【摘 要】
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目的:Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome,WAS）是一种罕见的X连锁隐性遗传的原发性免疫缺陷病,由WASP基因突变导致WAS蛋白（Wiskott-Aldrich syndrome protein,WASp）表达异常所致。WAS的临床表型差异较大,WASP基因突变、WASp表达水平均与临床表型密切相关。本研究采用minigene技术对一个有两个新发
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目的:Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome,WAS）是一种罕见的X连锁隐性遗传的原发性免疫缺陷病,由WASP基因突变导致WAS蛋白（Wiskott-Aldrich syndrome protein,WASp）表达异常所致。WAS的临床表型差异较大,WASP基因突变、WASp表达水平均与临床表型密切相关。本研究采用minigene技术对一个有两个新发突变位点的WAS家系进行体外研究,探索新发内含子突变对外显子的剪接作用并结合新发突变WAS家系中患者的临床表现分析基因型与表型的相关性。方法:1.收集家系患者临床资料、家系情况、蛋白表达以及测序结果;2.利用生物信息学在线工具The Mutation Taster和Poly Phen-2分析基因突变致病性;3.采用minigene法构建WAS野生型（mini-WASP-WT）、单外显子突变型（mini-WASP-Mut1）、单内含子突变型（mini-WASP-Mut2）以及双突变型（mini-WASP-Mut3）共4组重组质粒并进行COS-7细胞转染表达;4.逆转录实时荧光定量PCR检测空质粒、野生型及3组突变型重组质粒中m RNA的相对表达量;5.对逆转录cDNA产物进行直接测序并对比验证。结果:1.先证者及其表弟均有血小板减少伴小血小板、感染及出血等临床表现,临床评分为4分和5分,且有血小板减少家族史。两名患者均存在WASP基因新发外显子2上c.158T>C突变,导致p.L53P改变;表弟还存在第二新发内含子突变IVS2+14C>T。先证者流式细胞术及免疫印迹检测均显示蛋白表达明显减少。2.生物信息预测工具显示新发外显子c.158T>C突变的致病性预测结果为可能具有致病性。3.成功构建WAS野生型及3个突变型部分基因序列的重组质粒并通过测序验证显示mini-WASP-WT为正常基因序列、mini-WASP-Mut1有突变c.158T>C、mini-WASP-Mut2有突变IVS2+14C>T,mini-WASP-Mut3包含c.158T>C和IVS2+14C>T两个突变,细胞转染后验证转染成功的测序结果同上。4.逆转录实时荧光定量PCR检测结果显示mini-WASP-WT的相对表达量为1681.849;mini-WASP-Mut1的相对表达量为2498.951;mini-WASP-Mut2为2055.928;而mini-WASP-Mut3则为881.948。5.体外表达RNA的逆转录c DNA产物测序结果显示,包含内含子突变的mini-WASP-Mut2及mini-WASP-Mut3均得到的是包含前三个外显子的360bp的基因序列,无基因的增加或缺失;mini-WASP-Mut2与同mini-WASP-WT均一样为正常基因序列;mini-WASP-Mut1和mini-WASP-Mut3是只包含c.158T>C突变的360bp外显子序列。结论:本研究明确了WAS家系新发内含子突变不影响外显子的剪接,排除了该突变在转录水平使本WAS家系中表弟临床表现较重的影响。应用minigene法进行体外研究为探究WAS新发点突变的发病机制提供了新思路。
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