角膜疾病是目前全球第二大致盲性眼病，包括角膜瘢痕、变性、外伤、炎症在内的多种角膜疾病，都可能导致视力完全丧失。穿通性角膜移植术是目前临床上广泛开展的治疗某些顽固性角膜病变的重要措施，不但能够提高视力，还有助于控制急性感染性炎症，保证眼球的完整性。角膜移植是器官移植中成功率最高的手术，然而排斥反应仍是移植失败的首要原因。有资料统计，无血管的植床排斥的发生率为5％-10％，而在植床有大量新生血管或二次移植的高危因素患者中，排斥的发生率高达50％以上。角膜移植排斥反应是一个多因素参与、及其复杂和高度调节的反应过程。一般分为传入和传出弧两部分。传入弧主要是宿主对异源组织抗原的致敏。这些供体抗原可被宿主的抗原提呈细胞(APC)处理后提呈给宿主免疫系统。传出弧主要是宿主对外来抗原的反应。抗原提呈是免疫应答反应过程中的关键限速步骤。 近年来研究发现，核因子-κB(NF-κB)是一种能调节多种炎症和免疫基因表达的重要的转录因子，它在胞浆内与NF-κB抑制蛋白(IκB)结合呈非活性状态，在外来信号(病毒、氧化剂、炎症细胞因子、外来抗原等刺激剂)作用下，磷酸化的IκB被降解，暴露出核定位信号，NF-κB随之发生核易位，并与特定的κB序列结合，启动特定基因的转录，参与了免疫细胞的激活、淋巴细胞的发育、以及应激反应、炎症反应等过程。 自20世纪70年代初Stinman和Cohn首次报道树突状细胞(dendriticcell，DC)以来，DC的研究得到迅猛发展。尤其是90年代后期，DC体外培养取得成功，可以获得足够量实验所需DC来研究其生物学特性，DC逐渐成为免疫学研究的热点之一。DC是体内功能最强的专职APC，在机体针对病原微生物的免疫反应中起着关键性的作用。近年来，DC被发现在免疫系统中扮演着双重角色，除作为APC诱发免疫反应外，还能诱导中枢或周围性免疫耐受。在同种异体移植中，树突状细胞通过提呈异体抗原并表达共刺激分子，如CD80、CD86，激活受者初始型T细胞，诱导免疫应答。目前认为，DC既可引起移植排斥，也可诱导移植耐受，这取决于DC的来源及其分化发育状态。成熟DC可以激活静息T细胞而介导移植排斥；未成熟DC由于共刺激分子表达缺陷，而诱导T细胞的无反应性，导致免疫耐受。近来研究证实，将不成熟DC进行受体鼠术前输注，可以明显延长同种异体心脏移植物的存活时间。而且国外有人通过实验证实了对于阻断树突状细胞的抗原提呈以及抑制T细胞免疫应答，NF-κB是一个有效的靶基因。这个发现对于研制应用在各种免疫系统病理状态(例如敏感症、自身免疫性疾病、移植)的治疗剂起到了潜在的暗示作用。 因此，本研究将在建立大鼠同种异体角膜移植免疫排斥反应模型的基础上，了解NF-κB在免疫排斥反应过程中的表达变化，探讨其在排斥反应过程中所起的作用。继而通过人工合成NF-κB反义寡核苷酸来抑制NF-κB的活性，看是否能延长同种异体角膜植片的存活时间。以上是体内实验部分，在体外实验中我们首先要成功分离培养大鼠骨髓树突状细胞，并对其进行鉴定，然后将NF-κB反义寡核苷酸与细胞共培养，看其是否能抑制DC细胞的分化成熟，阻断免疫应答的通路，最终达到免疫耐受，为临床上同种异体角膜移植免疫耐受的研究提供实验依据。 第一部分:大鼠角膜移植排斥反应模型的建立及核因子-κB的表达 目的:了解核转录因子-κB在大鼠同种异体角膜移植排斥反应中的表达，探讨其在角膜移植免疫排斥反应中的作用。 方法:以健康SD大鼠为供体，Wistar大鼠为受体，建立同种异体穿透性角膜移植排斥反应动物模型，同时以自体原位角膜移植和正常大鼠角膜作为对照组。术后观察大鼠角膜排斥反应的发生情况；免疫组织化学法分别检测移植后1d、3d、5d、7d、10d、14d，NF-κB在角膜不同组织层次的表达；免疫印迹法检测移植后不同时间段NF-κBp65蛋白在角膜中的表达变化。 结果:同种异体大鼠角膜移植后植片全部发生排斥反应，平均存活时间为(8.23±2.15)天。而在自体原位移植组，术后1周前后炎症反应明显，但一周后植片水肿混浊逐渐消退，新生血管通常只达到植片与植床交接处。免疫组化结果显示：正常大鼠仅角膜上皮及内皮层表达NF-κB；异体移植组术后3d角膜上皮及基质层NF-κB表达有所增加，主要是胞浆阳性。5-7d基质层炎性细胞浸润增多，新生血管增多，管腔增粗，NF-κB在细胞中的表达明显增强，达最高峰(P＜0.05)，且阳性细胞主要为核阳性。术后第10-14d，角膜各层NF-κB表达逐渐减弱。自体移植组在术后第5-7d也有炎性细胞浸润，但所检测到NF-κB的表达明显弱于同时间段的异体移植组(P＜0.05)。免疫印迹提示：正常大鼠角膜可在65kD左右见到一条极不明显的蛋白条带。异体移植组NF-κBp65蛋白表达开始于术后第1d，随着时间的推移，其表达量逐渐增多，表现为硝酸纤维素膜上的蛋白条带变粗颜色加深，于5-7d达到高峰，后逐渐降低，14d接近正常水平。自体移植组术后7d所检测到的NF-κBp65蛋白量明显少于异体移植组7d所表达的蛋白量。 结论:NF-κB在角膜移植排斥反应中表达、活化，参与了同种异体角膜移植排斥反应的调控，可能在免疫排斥反应的发生过程中发挥重要作用。 第二部分:核因子-κB反义寡核苷酸对大鼠移植角膜存活时间的影响 目的:研究脂质体包裹的核因子-κB(NF-κB)反义寡核苷酸对大鼠同种异体角膜移植植片存活时间的影响。 方法:体外大鼠角膜基质细胞原代及传代培养；脂质体包裹的NF-κB反义寡核苷酸的人工合成；检测FITC标记的反义寡核苷酸对角膜基质细胞的通透性；建立大鼠同种异体穿透性角膜移植排斥反应动物模型；共分4组，移植术后当天开始用微量注射器分别以40μl/d的剂量结膜下注射经脂质包裹的NF-κB反义寡核苷酸、碱基错配寡核苷酸、空白脂质体和生理盐水，持续给药5d。观察移植排斥反应指数(RI)并判断移植片存活时间；术后7d各组分别处死5只大鼠，测定受体大鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)和细胞毒T细胞(CTL)活性，并用凝胶电泳迁移率(EMSA)法检测NF-κB蛋白的表达。 结果:游离的反义寡核苷酸可以进入角膜细胞内，脂质体包裹能够增加其对角膜基质细胞的通透性。反义寡核苷酸组大鼠的角膜移植片存活时间较对照组明显延长(P＜0.01)；MLR显示反义寡核苷酸组大鼠脾细胞对供体抗原刺激的增殖反应受到抑制(P＜0.05)；同样，此组大鼠的脾细胞的CTL的活性也明显减弱(P＜0.05)，在EMSA图上未见特异性NF-κB探针结合条带。 结论:脂质体包裹的NF-κB反义寡核苷酸有较强的细胞通透性，能有效抑制NF-κB的蛋白表达，继而抑制受体鼠对异体移植物的细胞免疫反应，使同种异体的角膜移植片存活时间延长。 第三部分:核因子-κB反义寡核苷酸对大鼠树突状细胞表型和免疫生物活性的影响 目的:将NF-κB反义寡核苷酸导入体外培养的大鼠骨髓树突状细胞(DC)，观察其对大鼠DC免疫、生物学特性的影响。 方法:采用直接分离和细胞因子(rrGM-CSF+rrIL-4)诱导相结合的方法体外分离、培养并鉴定大鼠骨髓DC。根据NF-κB反义寡核苷酸及脂多糖(LPS)应用与否，将培养的DC分为四组。(1)A组：单纯用rrGM-CSF+rrIL-4刺激培养DC；(2)B组：于培养开始时即加入10μmol/LNF-κB反义寡核苷酸，即rrGM-CSF+NF-κB反义寡核苷酸；(3)C组：于A组培养结束前18小时加入外源性LPS(150ng/ml)刺激。(4)D组：在B组培养结束前18小时加入LPS刺激。用倒置相差显微镜和扫描电镜进行形态学观察；流式细胞仪检测细胞表型；混合淋巴细胞反应进行功能学检测；凝胶电泳迁移率(EMSA)检测NF-κB蛋白的表达。 结果:本实验成功分离、诱导了大鼠骨髓来源的树突状细胞。从细胞形态来看，加入NF-κB反义寡核苷酸抑制了DC的分化成熟，而LPS则促进DC的成熟；流式细胞仪定量检测分析显示，无论在培养6d或10d，B组DC表达的所有表面分子均低于培养相同时间的A组DC荧光强度(p＜0.01)；混合淋巴细胞反应的结果与之相一致，即B组的DC刺激同种异体T细胞增殖的能力较A组低下；从EMSA结果可以看出，加入外源性NF-κB反义寡核苷酸可抑制NF-κB的蛋白活性，从而导致标记探针的NF-κB结合条带消失，并且即使受到LPS刺激后，仍能抑制NF-κB蛋白的表达，表明这种抑制作用具有持续性和不可逆性。 结论:DC的分化成熟是NF-κB依赖的，采用NF-κB反义寡核苷酸转染DC细胞可以抑制其分化与功能成熟。