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造血干细胞(HSCs)的主要来源是经造血干细胞动员的成人外周血以及脐带血,但由于造血干细胞体外大规模扩增非常困难、获取渠道少、复苏活性低、以及CD34+细胞占比低等缺点,导致目前广泛存储的脐带血失去能治疗恶性血液疾病的价值。致使这一宝贵的生物学资源浪费。间充质干细胞(MSCs)来源广泛,且有组织修复及调节免疫等重要功能,是目前临床应用最广泛的干细胞之一,但由于获取方法不同及供体情况的不同,造成间充质干细胞在体外扩增的数量和质量远不能满足不断增长的临床和科研需求。诱导性多能干细胞(iPSCs)技术是将成体细胞或者其他干细胞转入Oct-4、Sox-2、Klf-4和c-myc等四种或其他转录因子,使细胞重编程成为有类似胚胎干细胞生物学特征的多能性干细胞。本文基于诱导性多能干细胞技术对目前广泛存储的造血干细胞进行重编程,诱导其转化为多能干细胞,并大量扩增和最佳细胞系,并将诱导性多能干细胞重新定向分化为间充质干细胞,为临床和科研提供足够数量的间充质干细胞优质来源。本文的研究内容如下:1、将不携带病原体的脐带血中单核细胞以密度梯度离心法进行富集,检测其中的各种细胞群体,并对其形成集落能力进行验证,再将单核细胞进行磁珠分离,获取其中的CD34+细胞,采用全人工培养基进行体外小规模培养扩增,并检测其表面标记物和细胞纯度。采用三种混合游离环状基因载体作为多能性因子载体,将不携带病原体的造血干细胞进行电穿孔转染,并培养得到6株人诱导性多能干细胞,对细胞进行扩增和冻存。并检测每个细胞株形成克隆能力、生长水平、表面标记物表达率、三胚层分化潜能将上述因素进行分析以获得最佳细胞株用于定向分化。2.将最佳细胞株进行全人工培养基诱导,使其定向分化为间充质干细胞。采集同一供体来源的脐带华通氏胶,分离其中的脐带间充质干细胞。将两种来源的间充质干细胞三种分化能力进行验证。滴定流式细胞术抗体以及确定流式细胞术最佳细胞用量后用流式细胞术对两种间充质干细胞表面标记物进行检测。并检测两种间充质干细胞的微生物污染和细胞核染色体。3.对两种来源的间充质干细胞进行大规模培养,并对其同源性进行分析,比较两种细胞的生长能力,并对两种细胞的P3和P13代细胞表面标记物、细胞周期、凋亡水平、外泌体特异性抗体表达率及培养基中多种细胞因子表达率进行检测分析。结果:1.从无病原体污染的脐带血中分离的CD34+细胞量过低,需进行扩增,扩增获取的CD34+细胞总量为2.32*10~6,CD34表达率达99.4%,细胞纯度高。转染后的细胞于20日后肉眼可见iPSCs集落形成。同时得到的6株细胞均能强表达多能性干细胞表面标记物SSEA4,Oct4,SOX2,细胞生长曲线正常,接种后第三日起快速增殖。从以上数据分析,6株细胞均为iPSCs,其中最优细胞株为细胞株1,将细胞株1大量扩增后注射至免疫缺陷小鼠,小鼠可长出具备三胚层细胞的畸胎瘤。2.采用两步法能使iPSCs定向分化为间充质干细胞。且其和同一供体脐带来源间充质干细胞(UMSCs)均为长梭状,呈旋涡状生长,并能分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。通过流式细胞术抗体滴定确定其最佳流式抗体用量为2.5μL,对应最佳细胞数为1*10~5,以此条件进行流式细胞术鉴定原代细胞,两者均为CD73、CD90、CD105表达率大于95%,CD14、CD34、CD45、CD79a、HLA-DR表达率小于1%,确认两种来源的细胞为间充质干细胞,且两种细胞染色体形态均为正常的23对,无核形异常。3.两种细胞的STR分析显示高度一致,确认其来源相同,无外源基因污染。iMSCs生长能力优于UMSCs。iMSCs传至13代时的细胞表面标记物能正常表达,虽其阳性标记物表达率略有下降,但其阳性标记物CD73、CD90、CD105表达率均高于95%,阴性标记物表达率亦小于1%,可以用于临床治疗。而P13代UMSCs表面标物中CD73、CD90、CD105表达率均低于95%,其阴性标记物均小于1%,无法应用于临床治疗。两种细胞的P3和P13代细胞周期分析和细胞凋亡水平检测则显示两种细胞经过体外传代后凋亡期细胞增加。两种细胞P3代凋亡细胞比率均低于1%。P13代iMSCs凋亡细胞率为6.87%,UMSCs凋亡细胞率为44.41%,iMSCs凋亡晚期细胞和死亡细胞率低于同代次的UMSCs。两种细胞的外泌体特异性蛋白表达率亦随着传代次数增加而降低,同代次iMSCs外泌体特异性表面抗原CD63、CD29、CD73表达率显著高于UMSCs。两种细胞培养基上清液中肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、白细胞介素-6、转化生长因子-β1等4种因子的含量均为iMSCs显著高于UMSCs,随传代次数增加,iMSCs的多种因子分泌量有所下降,而UMSCs外泌因子量则显著下降。仅p3代UMSCs培养基上清中的白细胞介素-8量高于iMSCs,但P13代UMSCs细胞培养基上清液中该因子含量低于iMSCs。iMSCs血管内皮生长因子分泌量显著高于UMSCs,且随传代未见显著下降。结论:本研究构建了对脐带血来源造血干细胞的全人工诱导方案,使之能重编程为诱导性多能干细胞。并对iPSCs进行评价,选择最优细胞株向间充质细胞定向分化。构建了iPSCs向MSCs的全人工定向分化方案,使其能定向分化为iMSCs,且通过该方法获得的iMSCs在体外各代次的生物学特征均优于同供体来源的UMSCs。