研究背景：　　急性白血病（acute leukemia,AL)是儿童期发病首位的恶性肿瘤，以学龄前期儿童多见。据流行病学调查，我国0-10岁儿童白血病的发病率约为3/10万-4/10万，严重威胁着儿童的健康和生命。由于新型药物的应用及治疗方案的完善，急性白血病，尤其是急性淋巴细胞白血病(ALL)完全缓解（CR）率已达到95％以上，5年以上持续完全缓解（CCR）率可达65%-80%。但对于部分急性髓细胞白血病（AML）和难治性ALL，提高他们的长期生存率仍是目前的一大难题。　　白血病细胞对化疗药物耐药以及白血病复发是治疗失败的重要原因。而在评价白血病患儿预后的标准中，除基因突变等细胞遗传学改变与ALL的预后关系比较肯定外，一些用于评价的临床和治疗反应指标与预后之间还缺乏直接的对等关系。近年来的研究发现，白血病中存在Ras/PI3K/PTEN/Akt/mTOR和/或Ras/Raf/MEK/ERK关键信号转导通路的扰乱，这些通路与白血病发生、白血病细胞增殖、细胞凋亡抑制和细胞耐药相关。因此我们在本实验室前期研究的基础上，利用磷酸化流式细胞术检测这两条信号转导通路中的磷酸化蛋白p-Akt T308、p-Akt S473和p-ERK1/2，对它们与白血病临床表现、危险分级和治疗反应之间的关系作进一步研究。　　磷酸化流式细胞术能检测信号转导通路中磷酸化信号蛋白的表达，虽然具有较高的敏感性和可重复性，但是不能提供肿瘤细胞对外界刺激的动态反应。部分患者即使存在相关基因或上游酪激酶受体的突变，信号转导通路仍处于静止状态。单细胞网络图（single cell network profiling,SNCP）是在磷酸化流式细胞术的基础上，用细胞因子、生长因子等胞外调节剂对细胞进行刺激，观察细胞磷酸化蛋白状态的改变，从而能对同一标本进行动态的观察。干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）和FMS相关酪氨酸激酶3（FMS-related tyrosine kinase，FLT3）属于三型酪氨酸激酶受体，在存在FLT3和/或c-KIT突变的病例中能上调p-Akt和p-ERK1/2的表达，因此我们采用SCF和FLT3对标本进行刺激，从而观察个体的异质性。　　目前儿童白血病的治疗主要以化疗为主并辅以相应的支持治疗，必要时行骨髓移植。效果显著的同时带来一定的不良反应，甚至威胁到患者的生命。而部分患者因为对化疗药物耐药，最终导致化疗失败。研究证明化疗联合分子靶向治疗能提高某些药物的效应，纠正耐药，并且降低化疗药的使用浓度，以较低的强度达到相同的治疗效果，从而减少化疗相关不良反应。但分子靶向药物和何种化疗药物搭配能达到最佳的治疗效果，是否每一种化疗药物和分子靶向药物都能起到协同作用，这仍需要进一步的研究证实。因此我们采用K562细胞株，对Ras/PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路与耐药之间的关系和分子靶向治疗的应用做初步的研究。　　目的：　　1.采用本实验室前期研究所建立的磷酸化流式细胞术，检测白血病患儿骨髓或外周血细胞磷酸化蛋白p-Akt T308、p-Akt S473和p-ERK1/2的表达，分析Ras/PI3K/PTEN/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK通路与患儿临床表现、ALL危险度分型和治疗反应之间的关系，进一步探讨phospho-flow技术的临床应用价值。　　2.采用SCNP了解个体的异质性；　　3.采用AnnexinⅤ/PI凋亡检测方法，探讨K562细胞株在Ras/PI3K/PTEN/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK通路激活或抑制的状态下对化疗药物的敏感性，以及不同的分子靶向药物和化疗药物搭配的治疗效果。　　方法：　　1.流式细胞术检测磷酸化蛋白　　1.1、流式细胞术检测白血病患儿骨髓白血病细胞的磷酸化蛋白细胞因子作用　　取100μl骨髓或外周血，分别加入终浓度为20μg/mL的FLT3或终浓度为10μg/mL的SCF，37℃水浴分别作用3.5分钟和2分钟。　　细胞的固定和破膜　　裂解红细胞同时固定白血病细胞：每管加入红细胞裂解固定1×buffer2ml，在37℃水浴中作用10分钟（根据BD公司试剂说明书）；　　细胞破膜：每管加入1ml含90%甲醇的破膜工作液，将细胞管置于-20℃冰箱中孵育30min(根据BD公司试剂说明书)。　　细胞的荧光抗体标记　　（1）加入细胞表面CD抗体，识别幼稚细胞群：　　B-ALL: CD45-PerCP/CD10-FITC/CD19-PE/CD34-APC　　AML: CD45-PerCP/CD13-FITC/CD33-PE/CD34-APC CD45-PerCP/HLA-DR-FITC/CD33-PE/CD34-APC CD45-PerCP/CD15-FITC/CD14-PE/CD34-APC　　T-ALL:CD45-PerCP/CD5-FITC/CD7-PE/CD34-APC CD45-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE/CD34-APC　　（2）细胞内磷酸化抗体标记：　　对照管：CD45-PerCP/IGG1-Alexa488/IGG1-PE/IGG1-Alexa647；　　磷酸化蛋白检测管：CD45 PerCP/p-ERK1/2-Alexa488/p-Akt T308-PE/p-Akt S473-Alexa647　　（根据每个患者白血病细胞表达的免疫标志调整磷酸化抗体与CD抗体的组合）　　1.2、流式细胞术检测K562细胞的磷酸化蛋白　　细胞因子作用　　取细胞密度为1×106/ml的K562细胞1ml，分别加入终浓度为20μg/mL的FLT3或终浓度为10μg/mL的SCF，37℃水浴分别作用3.5分钟和2分钟。　　细胞的固定和破膜　　细胞固定：每管加入含16%细胞甲醛的CytoFix细胞固定液，使甲醛的终浓度为4%，在37℃水浴中孵育10分钟；　　细胞破膜：每管加入1ml细胞破膜Ⅲ工作液，将细胞管置于-20℃冰箱中作用30min。　　细胞的荧光抗体标记　　对照管： IGG1-Alexa488/IGG1-PE/IGG1-Alexa647；　　磷酸化蛋白检测管： p-ERK1/2-Alexa488/p-Akt T308-PE/p-Akt S473-Alexa647　　2、磷酸化蛋白不同状态下K562细胞对药物的敏感性　　⑴不加刺激剂和抑制剂的K562细胞作为对照细胞，加入U0126、LY294002和雷帕霉素的细胞作为抑制剂组，加入佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）的细胞作为刺激剂组。　　⑵将每组细胞分别加入各孔中，每孔50μL；分别加入DNR0.45μg/ml，Ara-C1.95μg/ml，对照组不加药；　　⑶37℃，5%CO2的培养箱中孵育48小时；　　⑷吸取细胞悬液100μl，分别加入AnnexinⅤ和PI个各5μl（根据BD公司试剂说明书）；　　⑸混匀，室温避光孵育15分钟。　　3.流式细胞术分析磷酸化蛋白　　采用FACSCanto流式细胞仪分析，K562细胞株采用FSC/SSC联合设门，白血病患儿骨髓或外周血采用CD45/SSC联合设门分析磷酸化蛋白p- Akt T308、p-Akt S473和p-ERK1/2的表达。　　凋亡检测采用阳性标准品及单标AnnexinⅤ和PI，确定阳性区域，分析K562细胞不同磷酸化蛋白状态下，化疗药物作用的凋亡率。　　结果：　　1.39例ALL有21例（58.9%）,31例非M3 AML有29例（93.5%），2例混合白血病（100%）表达一种及以上磷酸化蛋白；ALL和AML的阳性率，p＜0.05，差异有统计学意义；　　2.39例ALL患儿各种磷酸化蛋白的阳性率：p-Akt T30852.6%，p-Akt S47336.1%，p-ERK1/240.7%；　　31例非M3 AML患儿各磷酸化蛋白的阳性率：p-Akt T30877.3%，p-Akt S47328.6%，p-ERK1/260.0%；　　p- Akt T308、p- Akt S473和p-ERK1/2阳性率在ALL和AML之间无统计学差异；　　3. p-Akt T308在ALL和AML中的表达水平：p-Akt T308在ALL的阳性表达水平为（22.19±11.61）%，在AML为（42.66±25.29）%，p＜0.05，差异有统计学意义；　　p-Akt S473和p-ERK1/2的表达水平在ALL和AML之间无统计学差异；　　4. ALL患儿p-Akt T308表达阳性组与阴性组白细胞的水平：阳性组为（164.62±100.56）×109/ml，阴性组为（27.41±12.97）×109/ml，p<0.05，差异有统计学意义；　　p-Akt S473和p-ERK1/2阳性组和阴性组的WBC无统计学差异；　　5. ALL高危组和低危组患儿p-Akt S473表达水平分别为（14.59±6.48）%和（1.25±1.44）%，p-Akt T308为（18.55±13.84）%和（1.23±0.06）%，p-ERK1/2为（19.26±18.43）%和（2.53±0.05）%，p<0.05，差异均有统计学意义；相关系数等于1，p<0.01；　　6.磷酸化蛋白表达阳性与患儿治疗反应之间的关系：ALL患儿中2个以上磷酸化蛋白表达阳性与患儿早期治疗反应不佳之间存在相关性，相关系数为0.668，p<0.05。非M3 AML患儿中2个以上磷酸化蛋白阳性与患儿第1次诱导失败之间存在相关性，相关系数等于1，p＜0.01；　　7.三型酪氨酸激酶受体FLT3和SCF能诱导K562细胞和白血病患儿肿瘤细胞p-Akt T308，p-Akt S473和p-ERK1/2活化或活性增强。应用SCNP能观察到静态细胞的动态反应；　　8.磷酸化蛋白不同状态下K562细胞对药物的凋亡率：DNR诱导凋亡实验中，PMA组和对照组细胞的凋亡率分别为（23.40±2.78）%和（58.50±0.57）%；p＜0.05；U0126组和对照组细胞的凋亡率为（89.70±3.12）%和（58.50±0.57）%，p＜0.05；LY296002组和对照组细胞的凋亡率为（79.70±1.26）%和（58.50±0.57）%，p＜0.05；rapamycin组和对照组细胞的凋亡率为（88.60±2.04）%和（58.50±0.57）%，p＜0.05；Ara-C诱导凋亡实验中，PMA组和对照组细胞的凋亡率分别为（48.10±2.83）%和（65.15±0.21）%，p＜0.05；U0126组和对照组细胞的凋亡率为（63.80±0.15）%和（65.15±0.21）%，p＞0.05；LY296002组和对照组细胞的凋亡率为（72.60±2.07）%和（65.15±0.21）%，p＜0.05；rapamycin组和对照组细胞凋亡率为（82.50±0.33）%和（65.15±0.21）%，p＜0.05。　　9. Ara-C对p-ERK1/2抑制剂组细胞诱导凋亡率和对照组细胞的凋亡率无明显差异。　　全文结论：　　1.儿童白血病细胞存在磷酸化蛋白p-Akt T308，p-Akt S473和p-ERK1/2的表达；　　2. p-Akt T308在AML中的表达水平较ALL高，可作为预后预测指标之一；　　3.白血病细胞磷酸化信号蛋白p-Akt T308，p-Akt S473和p-ERK1/2可作为ALL危险度分型的指标之一；　　4. AL患儿存在2个及以上磷酸化信号蛋白表达与治疗反应不佳相关；　　5.三型酪氨酸激酶受体FLT3和SCF能增强或激活K562细胞株和白血病患儿肿瘤细胞p-Akt T308，p-Akt S473和p-ERK1/2的表达。应用SCNP有助于观察到个体的异质性；　　6.分子靶向治疗联合化疗能有效诱导白血病细胞凋亡，不同分子靶向药物和化疗药物搭配，治疗效果可能存在差异。