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背景和目的 B细胞非霍奇金淋巴瘤(Bcellnon-Hodgkin’sLymphoma,B-NHL)是恶性B细胞单克隆扩增的一组异源性恶性致死性疾病。近年来,随着研究和治疗水平的不断提高,尤其是利妥昔单抗(Rituximab)在临床的广泛应用,患者生存期逐渐延长,部分患者可治愈。然而肿瘤细胞耐药常导致治疗无效或病情复发,使一部分患者预后较差。目前研究表明,核因子кB(NuclearFactorkappaB,NF-кB)信号通路的活化可能是B-NHL耐药的主要原因之一[1]。B-NHL患者外周血中B细胞活化因子(BcellactivatingfactorblongingtoTNFfamily,BAFF)明显升高,且与疾病的进展性、严重程度及治疗敏感性有关[2,3,4]。BAFF受体(Bcellactivatingfactorreceptor,BAFF-R,BR3)是BAFF专用的调节B细胞存活的特异性受体,而非经典NF-κB信号通路是受BAFF/BAFF-R介导活化的主要通路。 我们前期在酵母三杂交实验中发现受体相互作用丝/苏氨酸激酶2(Receptor- InteractingSerine/ThreonineKinase2,RIPK2)与BAFF-R、肿瘤坏死因子受体相关因子3(TNFreceptor-associatedfactor3,TRAF3)三者间存在相互作用,其中TRAF3是非经典NF-κB信号通路中的负调分子,具有重要的枢纽作用,提示RIPK2作为细胞内蛋白,可能与BAFF/BAFF-R介导的非经典NF-кB信号通路活化引起的淋巴瘤细胞耐药之间具有潜在的联系。 本课题通过检测B-NHL患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)及淋巴结肿瘤组织中,非经典NF-кB信号通路相关目的基因mRNAs的相对表达水平,研究其与B-NHL耐药及疾病进展的相关性。通过MTT比色法研究BAFF对人伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma,BL)Raji细胞的促增殖作用,并用不同浓度的重组人BAFF刺激Raji细胞后,从基因与蛋白水平检测非经典NF-κB信号通路相关信号分子的表达情况,为B-NHL耐药机制的进一步研究提供线索,同时初步探讨RIPK2与BAFF/BAFF-R介导的信号通路的相关性。 材料与方法 本课题的外周血标本来源于2010年11月至2011年11月于军事医学科学院附属医院住院治疗的36例B-NHL患者,以及同期7名健康献血员。淋巴结肿瘤组织标本来源于2009年1月至2011年11月于军事医学科学院住院治疗的20例B-NHL患者。提取外周血及组织标本总RNA,紫外光分光光度计及1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性;用PrimerScriptReverseTranscriptase将RNA反转录成cDNA,-20℃保存。半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitativereversetranscriptionandpolymerasechainreaction,SqRT-PCR)扩增内参GAPDH,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。运用实时荧光定量聚合酶链反应(Realtimefluorescentquantitativepolymerasechainreaction,FQ-PCR)检测外周血PBMC及肿瘤组织中非经典NF-кB信号通路相关目的基因及RIPK2mRNAs的相对表达水平,结果运用2-△△Ct法进行计算,根据各项临床特征对患者分组,采用SPSS13.0软件进行统计分析,并应用Pearson直线相关分析统计两两目的基因mRNAs相对表达水平间的相关性,应用Spearman秩相关分析统计目的基因mRNAs相对表达水平与疾病进展程度的相关性。 用不同浓度(62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL)的重组人BAFF刺激Raji细胞24h、48h、72h后,应用MTT比色法研究BAFF对Raji细胞的促增殖作用。用不同浓度(20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL)的重组人BAFF刺激Raji细胞后,分别利用FQ-PCR和WestenBlot技术,检测非经典NF-κB信号通路相关信号分子基因与蛋白的表达情况,并用Pearson直线相关分析统计BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2与BAFFmRNAs相对表达水平间的相关性,用Spearman秩相关分析统计各目的基因mRNAs相对表达水平与重组人BAFF浓度的相关性。同时初步探讨RIPK2与BAFF/BAFF-R介导的非经典NF-κB信号通路的关联。 实验结果 1目的基因mRNAs在B-NHLPBMC中的表达情况: 按临床特征对B-NHL患者进行分组,各B-NHL患者组PBMCBAFF、BAFF-R、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相对表达水平均较正常对照组显著升高,P<0.05;男性组、淋巴瘤国际预后指数(LymphomaInternationalPrognosticIndex,IPI)评分0～2分组、年龄≥60岁组分别与女性组、IPI评分3～4分组、年龄<60岁组比较,PBMC目的基因mRNAs的相对表达水平无显著性差异,P>0.05;/ⅢⅣ期及耐药组PBMC目的基因mRNAs相对表达水平分别高于/ⅠⅡ期及非耐药组,P<0.05。 Pearson直线相关分析结果显示,各目的基因mRNAs的相对表达水平均相互呈正相关性,P<0.0001,表明目的基因的表达趋势具有一致性。对不同临床分期、非耐药/耐药组的数据进行Spearman秩相关分析,结果显示各目的基因mRNAs的相对表达水平与疾病进展程度正相关,P<0.0001,提示随着疾病的进展,目的基因的表达随之升高。 2B-NHL组织目的基因mRNAs表达情况: 按性别及IPI评分分组时,各组目的基因mRNAs相对表达水平无统计学差异。耐药组Bcl-xLmRNAs的相对表达水平显著高于非耐药组,P<0.05;耐药组BAFF、BAFF-R、 NIK、p52及RIPK2的表达水平较非耐药组有升高趋势,但无统计学差异,P>0.05。3重组人BAFF刺激Raji细胞的MTT实验: 不同浓度的重组人BAFF刺激人Burkitt淋巴瘤Raji细胞24h、48h、72h后,与对照组相比,各处理组OD值均有不同程度升高,不同浓度、不同时间点以及交互作用均有显著性差异(F(4.24)=425.88,P<0.0001;F(2.24)=519.73,P<0.0001;F(8.24)=5.50,P<0.0001)。表明BAFF可以促进Raji细胞的增殖,且随着重组人BAFF浓度的增加和作用时间的延长,Raji细胞增殖率逐渐上升,P<0.05,表明BAFF促增殖作用有明显的剂量-效应和时间-效应依赖性。 4Raji细胞目的基因的FQ-PCR实验: 加入不同浓度的重组人BAFF刺激Raji细胞后,BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2mRNA的表达较阴性对照组均升高,P<0.05。20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL3组之间,各目的基因mRNAs相对表达水平差异显著,P<0.05,且随重组人BAFF浓度的升高呈上升趋势。 Pearson直线相关分析结果显示,BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2均与BAFFmRNAs的相对表达水平正相关,P<0.0001。Spearman秩相关分析结果显示,各目的基因mRNAs的相对表达水平与重组人BAFF浓度正相关,P<0.0001,表明随着重组人BAFF浓度的升高,目的基因的表达升高。 5WestenBlot实验: 以不同浓度的重组人BAFF刺激Raji细胞,BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2蛋白的表达均随重组人BAFF浓度的升高而呈增强趋势。 结论与分析 Ⅲ/Ⅳ期、耐药B-NHL患者PBMCBAFF、BAFF-R、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相对表达水平分别高于Ⅰ/Ⅱ期、非耐药B-NHL患者以及正常对照组,提示上述目的基因的表达与B-NHL耐药及疾病进展性相关。耐药B-NHL肿瘤组织中BAFF、BAFF-R、NIK、p52、Bcl-xL及RIPK2mRNAs的相对表达水平均高于非耐药组,表明BAFF/BAFF-R介导的非经典NF-κB信号通路与B-NHL细胞耐药存在相关性,而RIPK2可能与该信号通路存在关联。 MTT实验结果显示BAFF能促进Raji细胞增殖,且BAFF的促增殖作用具有剂量和时间效应依赖关系。重组人BAFF刺激Raji细胞后,能激活非经典NF-κB信号通路,其活化程度与重组人BAFF的浓度相关,可引起下游靶蛋白Bcl-xL等抗凋亡因子的过表达,促进肿瘤细胞存活与增殖,表明BAFF可以通过非经典NF-κB信号通路调控Raji细胞的增殖。同时BAFF可以上调RIPK2的表达,提示RIPK2与非经典NF-κB信号通路之间可能存在功能联系。本课题为进一步探讨B-NHL的发生、发展及耐药的生物学机制,提供了新的线索。