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目的: 1、探讨告达庭体外抑制3种脑胶质瘤细胞生长的效果及分子机制。 2、研究告达庭对缺血性脑卒中小鼠的治疗作用及机制。 方法: 1、体外培养人星形胶质细胞瘤细胞(U251)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87)、大鼠神经胶质瘤细胞(C6)。待细胞贴壁后将各细胞株随机分为对照组、用药组(不同剂量—100μM、50μM、25μM的告达庭)。相差显微镜观察告达庭不同浓度下各细胞株的细胞形态及密度的变化;MTT检测法检测不同浓度告达庭干预下各细胞株的活性改变;流式细胞仪测定分析各细胞株细胞周期的变化;JC-1及DCFH-DA染色方法,检测细胞膜电位变化及细胞内活性氧的累积;Werstern blotting方法进一步研究告达庭抑制脑胶质瘤生长的分子机制。 2、采用线栓法制备右侧昆明小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。实验用小鼠随机分成假手术组、模型组和告达庭治疗组。在小鼠手术成功完成并经过不同干预因素处理后1d,2d,3d,采用Zea Longa评分法、足失误试验及圆筒实验对各处理组小鼠进行神经功能评分;3d后TTC染色及相关软件分析观察小鼠大脑脑梗死灶,测定梗死体积;干湿重称量的方法检测小鼠大脑组织含水量;免疫荧光染色法检测缺血侧脑组织中MPO、AQP4含量的改变。 结果: 1、相差显微镜观察三种脑胶质瘤细胞,发现与正常细胞相比,经过不同浓度(100μM、50μM、25μM)的告达庭干预的U251、U87及C6细胞,细胞形态发生明显变化,细胞数目及细胞突起明显减少。MTT结果显示,告达庭对三种脑神经胶质瘤细胞的生长均起到抑制作用,且这种抑制作用随浓度及时间的增加而增加,呈剂量依赖性和时间依赖性,与正常细胞相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。对细胞进行PI染色,流式细胞仪测定分析各细胞株细胞周期的变化,结果显示:对于不同的胶质瘤细胞,告达庭展现了不同的周期阻滞作用,对U251细胞株起到了G0/G1期阻滞,在U87细胞株中呈S期阻滞。对U251及C6细胞进行JC-1及DCFH-DA染色,结果显示,告达庭干预的胶质瘤细胞细胞膜电位发生改变,细胞内活性氧的含量增加,且增加的趋势呈剂量依赖性。Werstern blotting结果表明,经过告达庭干预的细胞,细胞内周期蛋白D1和AKT随告达庭浓度的增加呈下降趋势,Ser15-p53和Ser139-H2A含量随浓度的增加呈上升趋势,增加或下降的趋势呈剂量依赖性,而ERK、p38及JNK1/2的表达呈轻微下降,下降趋势不明显。 2、脑缺血模型建立1d,2d,3d不同时间点,与模型组相比告达庭治疗组的小鼠神经功能缺损情况均得到显著改善,告达庭治疗组与模型组相比,行为学评分具有明显差异,差异具有统计学意义(P<0.05)。TTC染色结果显示在MCAO后3d,告达庭治疗组的脑梗死体积较模型组降低。在MCAO后3d,告达庭治疗组的脑组织含水量较模型组明显减少。通过免疫荧光染色法对脑组织中MPO的浸润情况进行观察,结果显示假手术组脑组织中可见少量的散在分布的MPO+细胞,模型组MPO+细胞在脑缺血3d时向脑部浸润明显,告达庭治疗组中MPO+细胞数明显降低。同时对脑缺血3d时各治疗组的AQP4表达情况进行了观察,结果表明告达庭治疗组AQP4阳性细胞数较模型组显著降低。 结论: 1、高浓度的告达庭可通过诱导ROS产出、DNA损伤,同时伴随MAPKs/AKT通路的异常表达,最终诱导细胞周期阻滞,抑制脑胶质瘤细胞的生长,且这种抗肿瘤作用呈剂量及时间依赖性。 2、腹腔注射告达庭对小鼠脑缺血起到一定的保护作用,其机制可能是抑制了AQP4过度表达引起的细胞毒性水肿和中性粒细胞浸润引起血脑屏障损伤导致的血管源性水肿。