免疫标记作为表征分子表型最为直接的技术,其大体积样本的标记方法伴随着光透明技术的兴起不断地被发展和创新。而相应的跨尺度光学成像方法受光学原理的固有限制,在成像速度、分辨率/对比度和成像体积之间需要相互权衡,单从物理层面优化光学参数难以同时实现快速、高分辨和跨尺度的免疫荧光成像。化学操控是近年来提出的提高传统光学成像性能的独特思路,目前已经发展了多种相关的方法。在光学衍射极限范围内,化学层析成像通过操控荧光分子的“亮-暗”,使宽场显微镜具有层析能力,满足快速和高分辨的成像需求。为了突破光学衍射极限,另一种化学操控方法是组织膨胀,它通过操控样本尺寸使传统光学成像实现超越光学衍射极限的分辨率。两者结合序列切削成像策略均有潜力实现跨尺度成像。然而,以上两种化学操控的成像策略中,现有的化学层析策略对荧光控制的机理只能适用于荧光蛋白,不能适用于免疫荧光中常用的荧光染料;组织膨胀所采用的水凝胶较软且易碎,与序列切削成像系统不兼容。围绕上述问题,本文发展了适用于大体积免疫荧光样本的化学层析成像和膨胀切削成像方法,实现了快速、高分辨和跨尺度的免疫荧光成像,为促进免疫荧光标记的精细亚细胞结构的系统性研究提供了有效的手段。主要研究内容如下:（1）建立新的荧光染料分子淬灭与重激活（“on-off”）的控制方法,实现了免疫荧光样本的化学层析成像。基于对Alexa染料的分子结构分析,发现采用铁离子和去铁敏可操控Alexa系列染料的荧光“on-off”切换。将该类染料应用于免疫荧光标记和化学层析成像,能够很好抑制宽场成像中表层以下的离焦干扰;结合宽场序列切削成像系统,免疫荧光化学层析以1.36×10~8 voxel/s的扫描速度、0.116×0.116×1μm~3的体素分辨率获取了体积为4200×3200×1000μm~3的免疫标记小鼠脑组织中多巴胺能神经回路中轴突小结和神经因子的定位信息,实现了免疫荧光成像的速度、分辨率和跨尺度的兼容。（2）研制了适用于大体积免疫荧光样本的可切削的膨胀水凝胶,实现了免疫荧光组织膨胀序列切削成像。系统地研究了在膨胀显微镜中水凝胶的单体组分对凝胶机械强度和膨胀系数的影响规律,发现以2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸钠盐（AMPS-Na）作为超吸水试剂的膨胀水凝胶,比现有的膨胀水凝胶有更高的机械强度,可满足序列切削的要求;具有与现有的水凝胶相当的膨胀系数（～4×）,可满足超越光学衍射极限的成像需求。进一步地研究了该水凝胶在膨胀的免疫标记组织中各项性能参数,验证了该水凝胶满足膨胀显微成像的各项指标。结合高通量的斜光片序列切削成像系统,以1.66×10~9 voxel/s的扫描速度、144×144×101 nm~3的体素分辨率获取了体积为4600×4200×1000μm~3免疫标记的小鼠脑组织单个神经元的树突棘形态信息,为轴向扩展的超分辨跨尺度成像提供了方法。