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糖尿病是全球最危急的健康问题之一,目前已有4.25亿成人罹患糖尿病,其中90%以上为 2 型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)。胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)贯穿于T2DM始终,是T2DM发生的重要病理生理基础,改善IR对于遏制T2DM的发生发展具有重要意义。IR的发生是不同组织和细胞类型以及多种机制共同作用的结果。从中医角度分析IR发生机制,是由于过食肥甘、久坐少动、气机郁滞等多种原因引发的“中满内热”,一方面,土壅木郁则痰浊沉积于肝脏;另一方面,精微不归正化,外溢于四肢则出现骨骼肌组织脂质沉积,布散障碍则骨骼肌等组织细胞内能量缺乏。代综方(Dai-Zong-Fang,DZF)是导师基于20余年临床经验创立的治疗代谢综合征(Metabolic syndrome,MS)与IR的中药复方,由黄连、枳实等药味构成,具有清热化痰、行气除满之功效。课题组前期已开展药学、药效学、毒理学、临床研究及体外机制研究,但DZF的体内作用机制尚未明确。因而本课题基于中西医对IR的认识,旨在研究DZF对瘦素受体基因缺乏的自发性2型糖尿病db/db小鼠IR的作用及机制。目的:1.研究DZF对自发性2型糖尿病db/db小鼠胰岛素抵抗的作用。2.研究DZF对db/db小鼠胰岛素抵抗的作用机制。方法:1.动物分组、给药:6周龄SPF级雄性C57BL/Ksj-db/db小鼠以及10只同周龄雄性同窝野生型C57BL/Ksj小鼠经过适应喂养,db/db小鼠随机分为4组(n=10),每日灌胃给药,分别为模型组(予蒸馏水,db/db+Vehicle),二甲双胍组(予盐酸二甲双胍水溶液,db/db+Metformin 0.25g·kg-1),DZF低剂量组(予DZF提取物水溶液,db/db+DZF0.5g.kg-1,DZF-0.5),DZF 高剂量组(予 DZF 提取物水溶液,db/db+DZF 1 g·kg-1,DZF-1);10只野生型(Wild-type)小鼠作为正常对照组(予蒸馏水,WT)。经过12周药物干预后取材,对主要组织和脏器称重,用4%多聚甲醛溶液固定,或冻存于-80℃冰箱备用;部分骨骼肌组织切小块固定于2.5%戊二醛溶液中用于电镜检测。2.糖脂代谢及IR评价:每两周测定小鼠空腹血糖;,给药末期分别进行小鼠胰岛素耐量实验(ITT)及口服葡萄糖耐量实验(OGTT)。药物干预12周后取材,用胰岛素ELISA试剂盒测定血清胰岛素水平,并计算HOMA-IR。全自动生化仪检测血清脂质四项,试剂盒比色法检测血清NEFA水平,ELISA试剂盒检测血清瘦素含量。HE染色观察胰腺组织微观形态。3.肝脏病理形态观察与糖脂代谢评价:试剂盒比色法检测肝脏糖原含量、PAS染色观测肝组织中糖原情况。运用H&E染色观察肝组织微观形态、油红O染色观察肝脏内脂质沉积。试剂盒酶法检测肝内TG含量、WST-1法检测肝内SOD活力,全自动生化仪检测血清ALT、AST水平。4.肝脏组织蛋白与基因检测:Western blot检测肝脏内IRS-l/Akt,AMPK及磷酸化蛋白,NICD、Hesl蛋白相对表达量。RT-PCR检测肝脏内Fasn、Ppara、Cpt1a mRNA相对表达量。5.骨骼肌病理形态观察、蛋白与基因检测:运用H&E染色观察骨骼肌微观形态;借助透射电镜观察小鼠骨骼肌超微结构改变。Western blot检测骨骼肌中IRS-1/Akt,AMPK及磷酸化蛋白、骨骼肌细胞膜GLUT4蛋白的相对表达量。RT-PCR检测骨骼肌中Cd36及Cpt1b mRNA相对表达量。结果:1.DZF对db/db小鼠糖脂代谢的作用.:模型组db/db小鼠FBG为WT小鼠的2.3-5.3倍(p<0.001)。二甲双胍可显著降低db/db小鼠FBG,其中给药第4周降低FBG达47.1%(p<0.001)。与模型组相比,DZF给药2-8周可降低db/db小鼠FBG(p<0.05),给药第4周FBG分别降低23.2%与27.8%(p<0.01)。与WT小鼠相比,db/db小鼠均呈现血清各脂质成分显著升高(p<0.001或P<0.05)。二甲双胍显著降低LDL-C及TG水平(分别为p<0.01,p<0.05),升高HDL-C(p<0.05)。与模型组相比,代综方低剂量(DZF-0.5)与高剂量(DZF-1)均可显著降低LDL-C(p<0.05),降低分别达 43.9%与 35.8%,DZF-1 降低血清 NEFA 达 16.4%(p<0.05)。2.DZF对db/db小鼠IR的作用:模型组db/db小鼠OGTT曲线下面积为WT小鼠的4.3倍,二甲双胍、DZF-0.5与DZF-1给药组均可降低OGTT曲线下面积(分别为WT组的3.2,3.7与3.8倍)。模型组ITT曲线下面积是WT小鼠的8.0倍(p<0.001),而二甲双胍、DZF-0.5给药组与模型组相比,曲线下面积明显减小(分别为WT的4.7与6.7倍,p<0.001,p<0.05)。模型组db/db小鼠空腹胰岛素是WT小鼠的9.2倍,HOMA-IR是WT小鼠的38.4倍(p<0.001)。DZF-0.5与DZF-1给药组可明显降低血清空腹胰岛素水平,与模型组相比,分别降低79.8%,77.0%(p<0.001);HOMA-IR分别降低 79.2%与 78.5%(p<0.001)。3.DZF对db/db小鼠肝脏糖脂代谢的作用:糖原测定试剂盒测定及肝组织PAS染色均显示模型组db/db小鼠肝糖原显著低于WT小鼠(p<0.05),而二甲双胍给药组的小鼠肝糖原含量最低,与模型组相比有显著性差异(p<0.05),DZF未呈现特殊作用(p>0.05)。与WT小鼠相比,db/db小鼠肝质量(2.74±0.27 g)与肝系数(6.04±0.64%)均远高于 WT 小鼠(1.12±0.14g 与 4.56±0.35%)(p<0.001),DZF-0.5 与 DZF-1均可显著降低肝质量,DZF-1比模型组减小18.7%(pp<0.05),比二甲双胍组减小23.2%(p<0.01),肝系数比模型组降低20%(p<0.01)。db/db小鼠肝内TG含量是WT小鼠的4.8倍(p<0.001)。DZF-0.5与DZF-1均可明显降低肝脏TG含量,与模型组相比,分别降低35.1%与40.7%(p<0.01)。H&E及油红O染色显示,DZF给药组小鼠肝组织内脂滴显著减少。DZF-1与模型组及二甲双胍组相比,可显著降低血清ALT水平(分别为p<0.05);,与模型组相比,两剂量均可显著降低血清AST水平(分别为p<0.01)。DZF-1给药的db/db小鼠肝脏SOD活力比模型组小鼠明显提高(p<0.05),而DZF-0.5及二甲双胍给药有提高db/db小鼠肝脏SOD活力的趋势,但无显著性差异(p>0.05)。4.DZF对db/db小鼠肝脏IR关键通路的作用:Western-blot显示,DZF和二甲双胍均可提高db/db小鼠肝脏内Akt及AMPK磷酸化水平(p<0.05),有增加IRS-1磷酸化的趋势,显著降低NICD和Hes1蛋白表达(p<0.001,p<0.01和p<0.05)。二甲双胍及DZF给药组的db/db小鼠肝组织中Fasn表达显著降低(p<0.05)。此外,Ppara的mRNA表达在DZF给药的小鼠肝脏中有显著上调(p<0.05),而Cpt1a的表达未呈现显著性差异(p>0.05)。5.DZF对db/db小鼠骨骼肌能量代谢机制的作用:骨骼肌透射电镜显示,模型组db/db小鼠的骨骼肌纤维排列紊乱,溶解甚至断裂,Z线模糊变粗,H区和M线不清晰,线粒体肿胀肥大。与模型组对比,DZF给药的db/db小鼠骨骼肌纤维和线粒体形态趋于正常。DZF增加db/db小鼠骨骼肌IRS-1/Akt磷酸化蛋白表达(p<0.05)、提高AMPK磷酸化水平(p<0.01),促进GLUT4在骨骼肌细胞膜上的表达(p<0.001)。二甲双胍和DZF均可提高db/db小鼠骨骼肌中Cd36表达(分别为p<0.01,p<0.05)及 Cpt1b 的表达(分别为 p<0.01,p<0.05)。结论:1.DZF降低db/db小鼠FBG、LDL-C、NEFA及血清胰岛素水平,改善胰岛素耐量、葡萄糖耐量,降低HOMA-IR水平,显著改善IR。2.DZF降低db/db小鼠肝脏TG含量,显著减少肝组织脂质沉积,改善肝脏脂肪样变;降低血清ALT、AST水平,提高肝脏SOD活力,改善肝损伤。3.DZF改善db/db小鼠IR的机制可能是通过激活db/db小鼠肝脏及骨骼肌IRS-1/Akt信号通路调节胰岛素信号转导,激活AMPK蛋白、调控脂质合成与氧化关键基因表达,抑制肝脏NICD/Hes1信号通路、促进骨骼肌GLUT4膜转位,进而减轻肝脏脂质沉积,改善骨骼肌能量代谢而实现的。