通过田间试验研究生物刺激素(二苯基脲磺酸钙)对大豆根际土壤微生物群落及其理化性质影响,进而探讨生物刺激素对于优化大豆共生固氮环境,提高大豆生理指标和改善大豆品质功能的效果。本文的研究方法包括:1.采用中华费氏根瘤菌或不同浓度的生物刺激素对汾豆78号进行浸种,主要包括S1、S2、S3、S4、S5五个试验组和空白对照CK组,播种后在大豆花期采集大豆根际土壤,并通过对比改良SDS法、TSAI法、生工试剂盒法和Mobile试剂盒法进行土壤根际微生物DNA提取,最后选取效果最佳的提取方法。2.特异性扩增目的片段16s V3区,对扩增后的产物进行测序是使用罗氏公司的454测序仪(Roch GS FLX sequencer)。对数据处理后进行根际土壤微生物群落多样性分析、根际土壤微生物群落的香浓指数(Shannon-Wiener)曲线分析、根际土壤微生物群落结构分析、聚类分析和部分菌在genus水平的结构分析。3.分别对各组的根瘤数量、根系的活力、植株的干重、豆血红蛋白以及固氮酶的活性的含量等生理指标进行测定,分析实验数据。4.对AA3连续流动分析仪进行了检测和验证,并测定之前试验设计各个分组的大豆籽粒蛋白含量。通过上述研究方法测定的结果有:1.通过两种手提法和两种试剂盒法对土壤的根际微生物总DNA进行粗提并对比这些方法的提取效率和DNA纯度;然后使用靶标细菌16S V3区的引物进行PCR扩增并用琼脂糖凝胶电泳验证;其中Mobile试剂盒所提取的DNA条带信号强,重复性好。2.五个试验组与CK组相比,试验组香浓指数(Shannon)和菌群丰富度指数(Chao1)下降。试验组S2、S3、S4和S5与CK组对比,发现变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)对含量增加;酸杆菌门(Acidobacteria)和硬壁菌门(Firmicutes)相对丰度减少。试验还发现在属的水平上,一些对大豆生长有益和促进固氮的功能菌种有增加趋势。3.通过对植株根瘤数量统计发现,大豆植株根瘤数量各处理间呈现S5>S4>S3>S2>S1>CK趋势。通过根系活力测定发现,在苗期时,试验组S1、S4和S5根系活力较高;在初花期时,除试验组S2和S3外,大豆植株根系活力都有减弱,试验组S1减弱较明显,S4和S5大致保持在原有水平。通过植株干重统计发现,试验组植株干重相比较空白对照CK都有所提高,在苗期时,试验组彼此间差异不明显,但可以看出随着生育时期的推进,生物刺激素的效果逐渐表现出来,植株干重表现为S5>S3>S4>S2>S1>CK。通过根瘤固氮酶活性测定发现,S2、S3、S4和S5组活性相对较高,最终表现为S5>S3>S2>S4>S1>CK。固氮酶的主要功能组成成分是豆血红蛋白,因此施用不同浓度的生物刺激素对豆血红蛋白含量的影响与固氮酶活性的影响基本一致,表现为S5>S3>S2>S4>S1>CK。通过AA3连续流动分析仪测定大豆全氮含量来计算大豆蛋白含量,我们可以得出大豆籽粒蛋白含量呈现S5>S4>S3>S2>S1>CK。最后,通过对所得实验数据对比分析可得:1.Mobile公司的BIO-101 DNA extraction Kit试剂盒提取的DNA纯度高且所提土壤DNA中的腐殖酸含量少,且对16s V3区特异性扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段条带信号最强,重复性好。因此选择Mobile试剂盒法提取进行土壤根际微生物DNA提取,进行后续实验。2.施加生物刺激素会降低大豆根际土壤微生物的多样性;可以促进根瘤菌的生长,增加根际土壤微生物中根瘤菌的含量;同时生物刺激素还可以提高根际土壤微生物中功能菌属的数量,促进大豆固氮和生长发育。3.生物刺激素可以增加根瘤数和植株干重,提高根系活力。但是生物刺激素作用效果在大豆生长发育前期不明显,随着生育时期的推进,生物刺激素作用开始显现,所以需要配合根瘤菌液使用,保证大豆植株在前期生长的优势,因此同时施加生物刺激素和根瘤菌的试验组S4和S5则会在根瘤菌数、根系活力及植株干重等生理指标优于其它试验组。此外,生物刺激素还可以提高固氮酶活性和豆血红蛋白含量,并在40g/L-80g/L的浓度范围内,生物刺激素浓度越高对植株干重、固氮酶活性和豆血红蛋白含量提高越显著。4.生物刺激素可以提高植株与固氮菌的共生固氮效率,增加大豆籽粒蛋白含量,改善大豆品质,而且与根瘤菌液共同作用效果更显著。并且对连续流动分析仪进行了检测和验证,所测定大豆全氮含量的结果无显著差异且快速高效,说明利用连续流动分析仪快速测定大豆蛋白含量是可行的。为实验室后续大批量测定大豆籽粒蛋白建立切实可行的方法。