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目的线粒体是卵胞质中含量最为丰富的细胞器,其产生的ATP是卵子、受精卵以及胚胎主要的能量来源。研究证明在胚胎早期发育过程中,线粒体经历了一系列形态和位置的改变,其中,线粒体的结构尤其内膜的各种成分与线粒体的功能密切相关,因此,在此期间线粒体的功能状态改变直接影响植入前胚胎的生长和增殖。如果线粒体呼吸链受损,使得ATP产生减少,还能导致非整倍体的发生,并干扰正常的受精及胚胎发育而影响卵子的发育潜能。干扰素／维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19,GRIM-19)是线粒体呼吸链复合物Ⅰ的一部分,其对线粒体呼吸链复合体Ⅰ-Ⅳ的装配及线粒体呼吸链的电荷转移和电化学势能的维持都是必需的,GRIM-19缺乏会导致线粒体结构、分布、以致功能的异常。研究显示,缺乏GRIM-19的小鼠胚胎在9.5天死亡提示GRIM-19在胚胎发育中起着非常关键的作用,并且GRIM-19在心脏的早期发育中也起着重要的作用。目前尚无GRIM-19在植入前胚胎中表达情况的研究报道,GRIM-19在早期胚胎有何作用及作用机制仍不清楚。本研究通过检测GRIM-19基因在小鼠植入前胚胎的表达,观察GRIM-19在植入前胚胎的动态表达情况,探讨GRIM-19对早期胚胎生长发育的作用。方法1、小鼠超排卵及胚胎获取雌性性成熟昆明系小鼠,腹腔注射HMG10IU/只,48h后腹腔注射hCG10IU/只,与性成熟雄性昆明系小鼠按1：1比例合笼过夜。次日晨检查雌鼠阴栓,阴栓阳性的(hCG后27h)脱颈法处死雌鼠,取双侧输卵管,在实体显微镜下,取出受精卵,转入四孔皿,每孔中加入400μl预先在培养箱中平衡的G1培养液,覆盖矿物油,37℃、5%CO2培养箱内培养备用。分别在注射hCG后的46-48h、55h、65h、75h、84-86h取2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚及囊胚期的胚胎。2、胚胎分级8-细胞胚胎分级标准：1级,卵裂球等大、均质透明、无碎片；2级,卵裂球不完全等大、均质透明、无碎片；3级,卵裂球等大、均质但有少数碎片存在于卵间隙中；4级,卵裂球不等大、有碎片、颗粒不均变黑等。因有些级别的胚胎数太少为便于统计将1,2,3级胚胎列为优胚组(A组),4级为非优胚组(B组)3、Western blot分别将收集到的各期胚胎(500个)用PBS冲洗1-2次,加入20μl蛋白提取缓冲液,在超声波细胞粉碎机下超声20次(130watt,20khz,5s)。加入SDS样品缓冲液,100℃煮沸5min, SDS-PAGE电泳分离后将蛋白转至PVDF膜上,5%奶粉封闭,然后与兔抗鼠IgG/GRIM-19抗体(1：500),兔抗鼠p-actin抗体(1：4000)4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG作为二抗(1：5000),常温孵育1h。ECL化学发光法显色,胶片于暗室中曝光。用Image J软件获得各条带光密度值,以目的基因与内参β-actin比值表示其含量4、Real-time PCRi.配置胚胎裂解液和逆转录液(50μl体系,冰上配制)2μl NP-40,1μl RRI (Ribonuclease Inhibitor),10μl5×Prime ScriptTM Buffer (for Real Time),2.5μl Oligo dt Primer (50μM)×1,5μl Random6mers (100μM),22μl Rnase Free dH2O。ii.胚胎的裂解通过上述方法获取的各期胚胎,用Tyrode’s酸去除透明带,经PBS冲洗,在体视镜下用微吸管吸取20个卵裂球,吸入体积控制在5μl以内,分别加至己含细胞裂解液的无RNA酶的PCR管中,空白对照管中加入无细胞的等量PBS。放置冰上2h,充分裂解细胞。ⅲ.逆转录向上述各PCR管中加入3μl Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I混匀,反应条件：第一步,37℃20min,第二步,85℃5sec,第三步,12℃forever,第四部,stop。iv. Real Time PCR(20μl体系)10Oμl SYBR Premix Ex TagTM,0.2μl PCR F Primer,0.2μl PCR R Primer,2.0μl cDNA模板,7.6μl3dw灭菌。反应条件：95℃30sec,Holding stage；95℃5sec,60.0℃30sec,40cycles;95.0℃15sec,60.0℃1min,90℃15sec,Melt curve stage.5、显微注射抗体小鼠促排卵获取受精卵(如上所述),随机分为两组,a组(注射抗体组)使用显微注射技术将抗GRIM.19抗体注射至受精卵胞质中,b组(空白对照组)将等量的G1培养液注射至受精卵胞质中,观察受精卵的发育情况。结果1、GRIM-19蛋白在小鼠植入前各期胚胎中均有表达,其蛋白水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势,至囊胚期达到最低。2、GRIM-19mRNA转录水平从2-细胞期逐渐增高,至8-细胞期达高峰,随后呈下降趋势,至囊胚期达到最低。3、8-细胞胚胎中的优胚组GRIM-19mRNA水平明显高于非优胚组(P<0.05)。4、显微注射抗GRIM-19抗体组胚胎的成活率低于对照组,并且相对于对照组胚胎,实验组胚胎的生长发育受到不同程度的阻滞,胚胎不能正常发育至囊胚阶段。结论1.GRIM-19在小鼠植入前胚胎中持续表达,其表达量随发育时程的变化而改变,提示GRIM-19在早期胚胎发育过程中具有一定的作用,并随胚胎增殖进程而有所变化,其中具体的机制有待更深入的研究。2.GRIM-19的表达量与胚胎分级正相关,说明GRIM-19的表达与胚胎质量及发育潜能相关,提示GRIM-19可以作为评价早期胚胎发育潜能的一个潜在指标。3.GRIM-19蛋白的阻断能影响胚胎的存活率,并阻滞小鼠早期胚胎的发育,提示GRIM-19在胚胎的早期发育中发挥重要作用。