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近年来,硫化氢(H2S)已经从一种有毒、有臭鸡蛋气味的气体,转变成为继一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后的第三种气体信号分子。多种哺乳动物细胞均能产生H2S。人和大鼠血浆及多数组织中H2S的浓度约为50μmol/L,而脑中H2S的浓度可以高达150μmol/L。内源性H2S主要由胱硫醚-β-合酶(cystathionine β-synthase, CBS)或胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)分解L-半胱氨酸产生。CBS主要存在于神经系统中,而CSE主要存在于心血管系统中。内源性H2S对神经系统、心血管系统、消化系统和呼吸系统均有重要的生理调节功能。H2S对心血管系统存在保护性作用：舒张血管,降低血压；对心脏有负性肌力作用,并能减轻缺血再灌注引起的心肌损伤；减轻病理情况下血管结构和功能的慢性改变。2007年,本课题组首次发现H2S新的生物学活性,即H2S能够促进血管新生。血管新生,即血管外基质降解,血管内皮细胞增殖、迁移形成子代血管支的过程,主要发生在组织器官生长,创伤愈合,肿瘤等各种生理、病理过程中。血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)激活血管内皮细胞生长因子受体-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2, VEGFR-2)产生的级联反应是血管新生中最核心的信号通路,能够促进血管内皮细胞的存活、增殖和迁移。本课题组首次证实,H2S能够促进血管新生,该作用依赖于信号分子Akt(Protein kinase B, PKB)的磷酸化。时至今日,并未见其它有关H2S促血管新生作用的报道。H2S促体外血管新生的作用是在猴脉络膜-视网膜(内皮)细胞株(RF/6A)上发现的,该细胞株在早期发生过自发转化并已传代540次以上,与原代内皮细胞存在差异,不能完全代表体内的血管内皮细胞。H2S是否也能促进原代人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)体外血管新生呢?关于H2S直接作用的靶分子,至今还没有任何报道,极具挑战性。我们将在H2S促血管新生机制的研究中试图寻找H2S在内皮细胞中的靶分子。首先,我们研究了H2S对HUVECs体外血管新生的作用。在H2S的研究中,通常使用NaHS水溶液作为H2S的供体,原代培养的]HUVECs在6代之内使用。用BrdU掺入法检测H2S对HUVECs增殖的影响,结果显示,低浓度NaHS(10μmol/L)能够促进细胞增殖。用划痕损伤模型研究H2S对HUVECs迁移的影响,发现NaHS(30-200μmol/L)均能显著促进细胞迁移。内皮细胞体外管腔形成实验结果表明,NaHS (30-200μmol/L)均有促进HUVECs体外管腔形成的能力。我们进一步探讨H2S促进HUVECs体外血管新生的机制。我们发现,H2S促HUVECs增殖、迁移和管腔形成的作用能够被VEGFR特异性抑制剂SU5416、PI3K特异性阻断剂LY294002和HIF-1抑制剂CdCl2(Cadmium Chloride)所阻断,提示我们H2S可能通过VEGFR-2/PI3K/Akt, VEGFR-2/FAK信号通路促进血管新生,HIF-1很可能也参与其中。Western blot结果显示,NaHS (50μmol/L)能够提高细胞中VEGFR-2、PI3K、Akt、FAK的磷酸化水平,且能够提高HIF-1α的蛋白水平。VEGFR-2信号通路通常是由VEGF激活,然而Western blot和ELISA结果显示,H2S并不能显著提高内皮细胞中VEGF的表达,细胞培液中VEGF含量始终小于5pg/ml,提示VEGF很可能不参与H2S促血管新生的作用。H2S似乎能够不依赖于VEGF直接激活VEGFR-2信号通路。那么,该通路上的信号分子中有H2S直接作用的靶分子吗?我们建立了H2S与信号分子直接反应体系,体系中只含有NaHS (0-200μmol/L)、激酶重组蛋白(信号分子)、激酶底物、缓冲液和ATP,没有VEGF和其它细胞内成分。有趣的是,NaHS(30-200μmol/L)能够直接提高VEGFR-2的磷酸化水平及其激酶活性。H2S也能直接提高VEGFR-1的活性,而对PI3K、Akt重组蛋白的活性没有影响。我们首次发现了H2S直接作用的靶分子——VEGFR。为了进一步探索H2S与VEGFR之间的相互作用,我们使用AutoDock软件对H2S与VEGFR-2进行分子对接研究。结果显示,H2S/HS-最有可能结合在VEGFR-2的activation loop附近和activation loop的自发磷酸化位点(Y1054)上,而activation loop对VEGFR-2的激活至关重要。总之,我们在H2S促进HUVECs体外血管新生现象及其机制的研究中,首次发现了H2S直接作用的靶分子_VEGFR。H2S很可能通过直接与VEGFR-2的activation loop相互作用,提高受体的磷酸化水平及其激酶活性,激活VEGFR-2/PI3K/Akt和VEGFR-2/FAK信号通路,发挥促血管新生的作用。