在全世界范围内,缺血性脑卒中是一种高致死率和高致残率的疾病。尽管有最优内科保守治疗,但大脑中动脉梗死的死亡率仍然居高不下(41-79%),其中主要的死亡原因为：血脑屏障破坏导致的占位性脑肿胀、继发性颅内高压以及脑疝发生。然而目前尚无任何被临床证实有效的药物能够减轻血脑屏障破坏导致的血管源性脑水肿。迄今为止,去骨瓣减压术是拯救急性期脑水肿高发患者生命的最重要治疗手段,它的原理在于去除部分颅骨以降低颅内压和缓解颅骨对持续肿胀的脑组织的压迫。然而,该治疗措施并不能明显减轻脑组织水肿,且存在较多的副作用。有研究数据表明,接受手术的患者6个月死亡率高达31%；而在幸存者中有17%为重度残疾,22%最终成为植物状态。患者年龄也是影响手术预后的重要因素,老龄患者(60岁以上)接受去骨瓣手术后预后更差。因此,寻找一种能有效减轻血脑屏障破坏以及脑水肿的神经保护剂具有十分重要的临床价值。学界针对缺血性脑卒中的发病机制做了大量深入的研究,并且对有潜在价值的神经保护剂进行了筛选,包括麻醉镇静药物、抗癫痫药物、抗炎症细胞因子等,但最终都被临床试验证明无效。作用靶点过于单一且无法透过血脑屏障而在脑内达到有效浓度等因素可能是目前临床研究中神经保护剂无效的主要原因。治疗性低温作为一种非药物干预措施,能够作用于缺血级联反应中的多个靶点从而发挥神经保护作用,被认为是最有效的神经保护治疗手段之一。因此,低温的脑保护作用受到人们广泛的关注。Fay等研究报道,经过低温治疗后,重症脑损伤患者神经功能预后得到显著改善。研究显示,给予低温32℃治疗后,脑梗死面积由常温组的211mm2降至17mm2。COOL AID临床系列研究证实了治疗性低温与静脉溶栓药物联用的可行性和安全性。2014年欧洲开展了一项大型多中心、前瞻性的随机对照研究(EuroHYP-1),旨在进一步验证低温在缺血性卒中的治疗价值,以及比较治疗性低温联合最优药物治疗与单纯最优药物治疗疗效的比较。低温被认为是治疗缺血性脑卒中最有前景的治疗措施之一,但其治疗效果与启动时间密切相关：低温治疗缺血性脑卒中效果具有时间窗效应。目前观点认为,脑缺血发生后应该立即启动低温治疗以达到最优治疗效果,然而现实情况则是患者发生缺血性卒中后并不能立即接受低温治疗。主要原因为：1)低温治疗需要复杂仪器设备以及严密的床旁检测：2)由于目前低温治疗只能在医院内实施,患者卒中后往往不能在短时间内赶到医院,因此从卒中开始到低温启动的时间间隔是不可避免的,而正是这个时间间隔可能导致低温疗效的降低。有资料显示,患者从卒中开始到接受低温治疗至少需要2-3小时以上。不可避免的时间间隔耽误了患者接受低温治疗的最佳时机,从而对患者的生命以及预后都将会产生重大的影响。因此,寻找一个切合临床实际情况且有效的措施延长低温的治疗时间窗,同时探讨延长低温治疗时间窗的可能机制,对提高低温的疗效和应用范围,都具有十分重要的临床意义。磺脲类受体1-瞬时受体电位M4 (SUR1-TRPM4)是近年来发现的一个离子通道,由SUR1受体(调节亚基)与4个TRPM4亚基共同组成的异聚体。正常条件下,该通道在大脑组织中的表达量极低。脑组织缺血缺氧后,该通道在神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞以及脑微血管内皮细胞中的表达量迅速上升,其在内皮细胞中的表达量上升最为明显。细胞内ATP的耗竭以及钙离子的浓度升高可导致SUR1-TRPM4通道的开放,导致细胞外大量Na+流入细胞内,进而Cl-和水大量随着进入细胞内。细胞内过多的Na+和水可导致细胞发生肿胀,最终坏死。微血管内皮细胞和脑星形胶质细胞是血脑屏障最为重要的组成结构,其发生肿胀甚至坏死都将导致血脑屏障通透性升高和破坏。在缺血再灌注的情况下,血脑屏障的破坏导致血管源性脑水肿,甚至出现更为严重的情况----出血转化。目前多项动物实验与临床试验提示SUR1-TRPM4阻滞剂格列本脲能够减轻缺血再灌注引起的脑损伤,在脑功能保护中具有重要作用。格列本脲能减轻MCAO大鼠受损半球肿胀程度(21%降至8%),减少脑梗死面积(下降了40%),降低24小时的死亡率(从67%降至5%)。此外,格列本脲在改善神经功能评分以及保护大脑皮层与白质方面均优于去骨瓣减压术。一项回顾性分析研究中发现,伴有2型糖尿病的缺血性卒中患者,服用磺脲类药物相比未服药的患者,入院后的NIHSS评分更低,出院后随访的Rankin评分更低。最近一个小样本的临床研究报道,格列本脲能够有效地减轻缺血性卒中后脑水肿与脑梗死面积；每日3 mg的常规用量未导致低血糖等不良反应,显示出良好的耐受性。随后,Simard等研究发现格列本脲的有效时间窗长达卒中后10小时。Kimberly等也做了进一步的研究,采用了核磁共振方法证实该药能够减轻缺血后血管源性水肿。药物联合低温治疗是提高低温疗效的一个切实可行的治疗措施。尤其当脑缺血发生后,低温不能及时启动,药物神经保护剂有可能延长低温的治疗时间窗。Green等使用NMDA拮抗剂(MK-801)联合延迟低温治疗脑缺血再灌注损伤,6周后检测神经功能显示该联合治疗措施具有长期保护作用。Dietrich等报道,抗炎症细胞因子----白细胞介素10(IL-10)联合延迟低温治疗脑缺血同样具有长期保护效应。Liu等发现托吡酯能够延长低温治疗新生大鼠缺血缺氧性脑病的时间窗。此外,Lee等研究发现,阿托伐他汀能够延长低温对大鼠脑局灶缺血再灌注损伤的治疗时间窗。格列本脲和治疗性低温均能减轻脑缺血再灌注损伤,而且两者在作用机制相辅相成：1)格列本脲能够阻滞SUR1受体开放从而减轻脑水肿以及抑制脑细胞肿胀性坏死；能够抑制缺血再灌注后TNF-a的表达；2)治疗性低温能够减少细胞内ATP的耗竭、减少细胞钙离子超载从而减少通道的开放；此外低温能够抑制炎症因子的释放以及抑制氧化应激损伤。这为格列本脲与治疗性低温的联合提供了理论依据。除上述理论依据外,本课题组开展了前期研究工作：①体外实验,格列本脲联合低温能够显著提高神经元活性；②体内实验,格列本脲联合低温对大鼠脑缺血缺氧损伤具有更强的保护作用。在此基础上,本课题组提出以下假说：格列本脲能够延长低温对大鼠局灶性缺血再灌注损伤的治疗时间窗。为了验证上述假说是否成立,我们课题组进行了以下实验研究。一、确定低温对大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤的治疗时间窗1.背景和目的：低温是一种治疗缺血性卒中很有前景的非药物措施,能够减轻脑水肿,减小梗塞体积以及改善神经功能评分。然而,低温的治疗效果受到启动时间窗的影响。大脑缺血后启动低温的时间越快,其达到的效果越好,因此低温存在治疗的时间窗。本研究旨在确立低温的治疗时间窗,为后续研究格列本脲能否延长低温治疗时间窗作铺垫。2.实验内容和方法：(1)建立缺血3小时MCAO大鼠模型；(2)低温干预方法：分别在缺血后0、2、4和6小时实施低温治疗,大鼠麻醉后置于4℃的环境中,约15分钟左右肛温降至33℃,随后大鼠置于大鼠体温维持垫上,体温监测探头实时监测,低温状态(33℃)持续维持约2小时。2小时低温治疗结束后予以缓慢复温(以0.5℃/h复温)至37℃。(3)在脑缺血24小时后,比较单纯缺血对照组与低温组(不同时间点启动低温)的脑肿胀指数与梗死体积。3.实验结果：单纯缺血组大鼠脑肿胀指数为11.199%,延迟0h低温组大鼠为4.304%(P<0.001),延迟2h低温组大鼠为5.109%(P<0.001),延迟4h低温组大鼠为7.799%(P<0.05),这三组大鼠脑水肿指数均明显小于单纯缺血组。而与单纯缺血组比较,延迟6h低温组大鼠脑水肿指数为11.298%(P>0.05),无明显统计学意义。低温能够减轻MCAO大鼠的脑水肿(P<0.001)。单纯缺血组大鼠脑梗塞体积为40.434%,延迟0h低温组大鼠为27.451%(P<0.001),延迟2h低温组大鼠为32.048%(P<0.001),这三组大鼠脑水肿指数均明显小于单纯缺血组。而与单纯缺血组比较,延迟4h低温组大鼠为38.546%(P>0.05)与延迟6h低温组大鼠脑水肿指数为41.131%(P>0.05),无明显统计学差异。4.结论：低温治疗能够有效地减轻缺血后脑水肿程度以及减少脑梗塞面积；低温减轻缺血后脑水肿与减少脑梗死面积存在一定范围的治疗时间窗：在本实验模型中,低温减轻脑水肿的治疗时间窗为缺血后4小时内,而减少梗塞面积的治疗时间窗为缺血后2小时。二、格列本脲增强延迟性低温对大鼠脑局灶缺血再灌注损伤的治疗效果1.背景和目的：低温作为治疗脑缺血最为有效的措施之一,其应用受限于较短的时间窗。本课题组前期己研究证实了低温治疗MCAO大鼠确实存在时间窗效应,在此基础上,本部分研究将证实格列本脲能否增强低温抗脑水肿的效果以及延长低温的治疗时间窗。2.实验内容和方法：(1)建立缺血3小时MCAO大鼠模型；(2)低温干预方法：分别在缺血后6、8和10小时实施低温治疗,大鼠麻醉后置于4℃的环境中,约15分钟左右肛温降至33℃,随后大鼠置于大鼠体温维持垫上,体温监测探头实时监测,低温状态(33℃)持续维持约2小时。2小时低温治疗结束后予以缓慢复温(以0.5-C/h复温)至37℃。(3)药物干预方法：在缺血后立即给予腹腔注射格列本脲溶液(首剂10μg/kg,后续每6小时1.2mg,3次)。(4)在缺血后24消失,比较常温溶媒组,格列本脲组,低温组(单纯低温：分3组在缺血后6、8和10小时实施低温治疗)与联合治疗组(格列本脲加低温：分3组在缺血后6、8和10小时实施低温)脑肿胀指数、脑梗死面积、神经功能评分与Evans Blue渗出量。3.实验结果： 单纯MCAO后脑肿胀指数为11.281%,使用延迟6小时低温后,脑水肿指数为11.315%,两组无明显差异(P>0.05)。单纯使用格列本脲治疗后,脑水肿指数降为7.685%(P<0.001),而将低温与药物联用后,脑水肿指数进一步降低为4.085%。显然低温与格列本脲联用后减轻脑水肿效果明显增强,优于单用格列本脲(P<0.001)和单用低温组(P<0.001)。MCAO后脑梗死体积为41.102%,使用延迟6小时低温后,梗塞体积为41.814%(P>0.05),两组无明显差异。单纯使用格列本脲治疗后,脑梗塞体积为39.200%(P>0.05),而将两者联用后,梗塞体积降低为29.970%。显然低温与格列本脲联用后减轻脑水肿效果明显增强,优于单用格列本脲(P<0.001)和单用低温组(P<0.001)。神经功能评分：常温vehicle组神经功能评分的中位数为10,平均为12.65；而延迟低温组为10,平均为12.72,这两组均属于重度神经功能损伤。格列本脲组为8,平均为9.57,属于中度神经功能损伤。联合治疗组神经功能评分中位数为6,平均为6.83,属于轻度神经功能损伤。联合治疗组与Vehicle、单纯延迟低温以及单纯格列本脲组相比较,均有统计学差异(P<0.05)。Evans Blue渗出量检测：假手术组两侧半球相比几乎接近为1。皮质层伊文斯兰的渗出量比值(患侧／对侧)：Vehicle组4.463倍,延迟低温组4.438倍,格列本脲组2.919倍,而联合治疗组1.333倍,与Vehicle、单纯延迟低温以及单纯格列本脲组相比较,均有统计学差异(P<0.05)。纹状体伊文斯兰的渗出量比值(患侧／对侧)：Vehicle组4.202倍,延迟低温组4.174倍,格列本脲组3.589倍,而联合治疗组2.375倍(P<0.05)。4.结论：格列本脲增强延迟低温对缺血性脑卒中后脑水肿与脑梗塞体积的治疗作用,即格列本脲能够延长低温的治疗时间窗；格列本脲联合低温能够进一步改善MCAO大鼠的神经功能；格列本脲联合低温能够有效地减轻MCAO损伤后血脑屏障破坏。三、格列本脲联合延迟低温能够降低促炎症因子的释放1.背景和目的：SUR1通道阻滞剂格列本脲能够延长低温减轻缺血后脑水肿的时间窗,其联合作用能够改善缺血后神经功能以及保护血脑屏障的完整性。本部分研究旨在观察SUR1蛋白在MCAO后的表达改变,以及格列本脲与低温联合作用能否抑制促炎症因子的释放。2.实验内容和方法：采用免疫组织化学与Western blot方法,检测MCAO大鼠脑组织SUR1的蛋白表达量；采用Western blot方法检测MCAO后大鼠脑组织促炎症因子的表达量。3.实验结果：Western blot显示正常组织仅有极低的SUR1表达量,而各实验组缺血组织均有较高的表达量。各实验组SUR1表达量无明显差别。该结果提示,在缺血后的脑组织内SUR1表达明显升高。Western blot显示正常组织仅有极低的炎症因子表达量,而各实验组缺血组织均有较高的表达量。其中格列本脲联合延迟低温组炎症因子均低于其他各组。该结果提示,在缺血后的脑组织内炎症因子水平上升,格列本脲联合延迟低温可以降低炎症因子水平。4.结论：SUR1在MCAO大鼠脑梗死区表达上升,各处理组的SUR1没有明显差异； 格列本脲联合延迟低温组可以抑制促炎症因子释放。小结：1、我们建立大鼠脑局部缺血3小时模型,在缺血开始后0、2、4、6小时予以低温治疗,从而探究低温治疗缺血性脑卒中的时间窗。结果发现,在缺血后0、2、4小时启动低温能够减轻脑水肿,而在缺血后0,2小时启动低温能够减小梗塞体积。提示低温治疗脑缺血后损伤有时间窗效应；2、基于前期低温治疗时间窗的基础上,我们在缺血后立刻予以格列本脲并且在6、8、10小时时予以低温联合治疗,旨在探究格列本脲是否能够增强并延长低温的治疗效果。结果发现,格列本脲组联合缺血后6、8小时点低温能够有效减轻脑水肿与脑梗塞体积；格列本脲联合缺血后6小时启动低温能够有效改善神经功能评分和减轻Evans Blue渗出。提示格列本脲能够增强在脑缺血后6、8小时启动低温的疗效；3、我们进一步验证SUR1蛋白以及炎症因子的表达量改变。结果显示,脑缺血后SUR1受体表达量明显升高；格列本脲联合延迟低温能够显著降低炎症因子的水平,提示联合治疗发挥作用可能与炎症因子的降低有关。