干扰素(interferon,IFN)是动物细胞产生和释放的一类具有抗病毒、抗细胞增殖分化及免疫调节等功能的高生物活性糖白质。干扰素-τ是一种独特的干扰素,属于Ⅰ型干扰素,作为一种胚源性妊娠信号,无需病毒诱导表达,除了在妊娠建立过程中发挥重要的生物学功能外,干扰素-τ还具有较高的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物学功能,而且与其他Ⅰ型干扰素相比,高浓度干扰素-τ的细胞毒性较小,而抗病毒活性却相当。目前实验室利用大肠杆菌表达系统获得的bIFN-τ几乎以包涵体的形式存在,通过复杂的变性复性才能获得少量有活性的bIFN-τ。因此,本试验根据大肠杆菌对密码子的偏好性优化了 rBoIFN-τ基因,尝试利用分子伴侣蛋白和化学分子伴侣共表达作用获得可溶性的rBoIFN-τ,为其规模化生产以及实际应用奠定基础。试验1、rBoIFN-τ在大肠杆菌中的原核表达根据大肠杆菌对密码子的偏好性优化rBoIFN-τ基因,然后克隆到冷表达载体pCold Ⅱ中,构建rBoIFN--τ表达载体,并在大肠杆菌E.coli中进行异源表达。通过诱导条件的优化,以期获得rBoIFN-τ在大肠杆菌中更高效的表达。结果显示,rBoIFN-τ基因成功克隆到冷表达载体pCold Ⅱ中,得到重组质粒pCold Ⅱ-rBoIFN-τ,然后重组质粒成功转化到大肠杆菌表达系统中,通过诱导表达获得分子量约为20 kD的目的蛋白,但是仍以包涵体形式表达。IPTG浓度为0.08 mmol/L、诱导温度为15 ℃、诱导时间为12 h和诱导转速为200 rpm是rBoIFN-τ的最佳诱导条件。试验结果表明,bIFN-τ在大肠杆菌表达系统中进行异源表达得到的为包涵体蛋白。试验2、分子伴侣对rBoIFN-τ在大肠杆菌中表达形式的影响在试验一中通过对bIFN-τ基因进行优化,构建表达载体,但在大肠杆菌中异源表达的目的蛋白仍然为包涵体。试验一组,将优化后克隆得到的重组质粒pColdⅡ-rBoIFN-τ分别转化到含有不同分子伴侣组合质粒(pKJE7、pGro7、pGTf2及pTf16)的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中;试验二组,将不同终浓度的甘油、海藻糖、D-甘露醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)、咪唑、L-精氨酸分别与不含分子伴侣质粒的大肠杆菌重组菌株BL21/pCold Ⅱ-rBoIFN-τ共表达。结果显示,试验一组,通过双酶切鉴定重组分子伴侣质粒共表达体系已成功构建,诱导表达后在50 kD和20 kD处出现两条蛋白条带,分别为分子伴侣蛋白和rBoIFN-τ目的蛋白,目的蛋白为包涵体;试验二组,7种化学分子伴侣在相同条件下与大肠杆菌重组菌株BL21/pCold Ⅱ-rBoIFN-τ共表达,得到分子量为20 kD的包涵体蛋白。试验结果表明,分子伴侣蛋白和7种化学分子伴侣均对rBoIFN-τ的可溶性表达未起到明显作用。试验3、rBoIFN-τ的纯化与抗病毒活性测定在试验一中得到的rBoIFN-τ包涵体,通过对其洗涤、溶解变性、纯化和复性步骤得到上清样品,采用MDBK-VSV系统微量细胞病变抑制法测定rBoIFN-τ上清样品的抗病毒活性。结果显示,rBoIFN-τ包涵体的纯度提高了 1.7倍,纯度达到97.2%,在最佳诱导条件下复性得到的可溶性重组蛋白的表达量约为376 mg/L,并且rBoIFN-τ样品的比活达到8.01×106U/mg。试验结果表明,rBoIFN-τ成熟蛋白在复杂的变性复性后具有较高的抗病毒活性。试验4、rBoIFN-τ对仔猪生长性能及疾病发生率影响试验将妊娠期为105 d的母猪30头随机分为3个组,试验一组对母猪肌注rBoIFN-τ 2 mL,对其所生仔猪分别在第7 d和断奶前肌注0.5 mL和1 mL,试验二组和对照三组分别肌注干扰素SNTA和生理盐水,记录初生均重、断奶均重以及各组仔猪的发病情况。结果显示,试验一、二组和对照三组仔猪平均日增重分别为0.226、0.221和0.207 kg/头·d,rBoIFN-τ组与对照组差异显著(P<0.05)。试验一、二组和对照三组仔猪的发病率分别为15.7、17.5和21.7%,rBoIFN-τ组与对照组差异显著(P<0.05)。试验结果表明,rBoIFN-τ能够明显提高仔猪的生长性能,使仔猪发病率降低。