血吸虫病是由血吸虫感染引起的分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。血吸虫在生长发育方面的表现非常特殊、复杂,在整个生活史循环过程中,呈现显著的生物学和形态学变化。这种不同发育阶段的形态学上和生物学上的变化必然伴随着不同的基因差异表达模式,导致血吸虫独特的代谢和发育过程。基于此本论文开展了日本血吸虫期别差异表达基因的筛选研究,并对部分差异表达新基因进行了克隆分析,为从分子水平探索血吸虫自身生长发育及其与宿主相互作用机制建立重要基础,以开拓防治血吸虫病的新途径。 一、日本血吸虫发育期别差异表达基因的筛选研究 应用抑制性消减杂交技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫三个发育期别的差异表达基因cDNA质粒文库。多项评价结果表明,所建差异表达基因文库质量较高,适用于在整个基因组水平分离日本血吸虫差异表达基因。对来自三个文库的共257个EST序列的分析提示:来自尾蚴消减文库的ESTs所代表的基因多与运动、能量代谢、转录调节及致病性相关;来自虫卵消减文库的ESTs所代表的基因可能参与信号转导、细胞粘附、蛋白质和碳水化合物的代谢以及抗氧化反应;而来自成虫消减文库的ESTs所代表的基因多参与蛋白质的合成、转运、分解代谢及虫体的运动等功能。 利用cDNA微阵列技术进一步筛选和鉴定期别差异表达基因。由尾蚴、虫卵和成虫的消减文库挑选共3111个插入片断大于500bp的基因克隆制成cDNA微阵列。杂交结果显示共有1620个克隆在实验组与对照组间呈现差异表达。其中尾蚴差异表达基因克隆374个,虫卵差异表达基因克隆701个,成虫差异表达基因克隆545个。应用RT-PCR及Northern blot对部分差异表达基因克隆进行了验证,其结果与芯片杂交结果相一致,进一步肯定了芯片杂交输出结果的可靠性。研究结果表明抑制性消减杂交结合cDNA微阵列用于大规模、高通量筛选血吸虫不同发育阶段的差异表达基因是可行的。从上述差异表达基因中选择108个杂交结果重复性比较好的克隆测序分析,结果表明代表44种单基因。所匹配的5个血吸虫已知基因已被报道为差异表达基因,所匹配的6个血吸虫已知基因经本研究发现为差异表达基因;并发现其余测序的克隆所代表的33种单基因中,一个与假想蛋白基因相似,一个与红色蚓氨肽酶基因同源,另外31种均为血吸虫未知的新基因。本研究获得了有关血吸虫期别差异表达基因大量新的数据和结果,必将有助于深入研究血吸虫的生长发育及其与宿主的相互作用机制,为开拓防治新途径提供了重要基础。 二、日本血吸虫发育期别差异表达新基因全长cDNA的克隆与分析 应用RACE技术扩增获得6个日本血吸虫发育期别差异表达新基因的全长cDNA序列。其中1UE12、1VE5、1ZD11和1XA1为尾蚴阶段高表达,3XB11和36D4为成虫阶段高表达。利用生物信息学分析工具对新基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、抗原位点进行了分析预测,对编码蛋白的保守功能域、结构位点及其同源性的蛋白进行了搜索。结果显示:1VE5和1XA1编码蛋白分别具有线粒体ATP合成酶、核糖体蛋白L35a的保守功能域;1UE12、1ZD11和3XB11的编码蛋白均为分泌型,可能作为重要的信号分子起作用,其中1ZD11编码蛋白与分泌型信号分子Wnt7家族具有部分同源性;36D4编码具有两个跨膜区的膜蛋白,与蛇根碱受体具有一定的同源性,