心肌梗死已成为危害老年人身体健康的主要疾病之一。目前药物治疗(抗凝、溶栓)、冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路搭桥虽能改善症状,使闭塞血管再通,却不能再生心肌。近年来的研究发现,人体存在多器官来源的干细胞,这些干细胞具有多向分化潜能,可以直接定向分化为成熟心肌或间接促建心肌细胞再生。目前胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、骨骼肌卫星细胞、心肌干细胞以及最近发现的诱导多能干细胞等多种细胞,已被用于体外实验和缺血性心肌病动物模型的研究。随着干细胞技术的出现和成熟,人们在这一领域取得了前所未有的进步。干细胞移植为病损心肌的重建和功能恢复提供了一种全新的治疗策略。　　 然而,两大问题困扰着干细胞从基础到临床的转化:(1)如何提高干细胞向心肌细胞分化的诱导效率?(2)如何提高干细胞在移植后梗死心肌的存活率?本课题围绕第二个问题展开研究。　　 干细胞能够向心肌细胞分化,具有修复心肌组织的潜能。一般认为,干细胞执行心脏修复的功能,需要一定数量的具有活性的干细胞作为基础。但是移植后的存活率极低。一些研究报道骨骼肌成肌细胞70-80％在移植后3天内死亡,而另一些研究组报道的死亡率更高,2天内死亡率达93％。有文献报道,在自身免疫缺陷小鼠模型中,移植间充质细胞4天后仅有少于0.44％细胞存活；而采用冠脉注射法对大鼠移植干细胞,4周后仅余0.55％的干细胞存活。可见,在进行了MSCs移植后,可发生大量的细胞损失(cell lose)。MSCs移植的治疗效果与细胞在移植入心肌的原位存活率密切相关,只有具备长期存活力的干细胞,才能够向心肌细胞分化,执行心肌修复的能力。因此,细胞的大量丢失在极大程度上限制了干细胞移植的效果,这一观点不仅有大量的动物实验支持,同时得到了许多临床试验的验证。低氧是细胞损失的重要因素,低氧通过造成大量的细胞损失在极大程度上限制了干细胞移植。在体内环境中,低氧与血清剥夺共同发挥作用,诱导细胞凋亡。也是本研究使用糖氧剥夺模型诱导细胞死亡的理论基础。　　 为了提高干细胞移植后的存活率,国内外学者采取了各种各样的努力,并发展了许多有效的策略,比如Bcl-2或Akt,GSk-3D基因修饰的MSCs对心肌梗死大鼠进行治疗,发现存活率,血管密度以及大鼠心脏功能的恢复得到改善。然而基因转染可能会导致免疫排斥,癌变等问题。那么是否存在单纯物理方法就能提高干细胞的心肌存活率?既往有报道热休克能促进神经元存活,但对干细胞的保护效应国内外至今未见报道。因此,本课题将围绕热休克对干细胞的效应进行研究:(1)热休克能否促进干细胞存活?(2)若能促进存活,其中起关键作用的分子伴侣是什么?其调控机制是什么?(3)该分子伴侣的靶标是什么?回答这些问题,以期解决干细胞移植治疗心肌梗死的部分关键问题。　　 [实验结果]　　 1.热休克显著促进热休克蛋白70(Hsp70)上调:将骨髓来源的Sca-1细胞种植在培养皿24小时后行热休克处理(42℃,0.5％CO2),时间分别为15min,30min,1 h,2h,3h。而非热休克细胞(control,CL)则在37℃,0.5％CO2环境中放置3h。处理结束后收集蛋白,用免疫印迹检测Hsp20、Hsp27、Hsp70、Hsp90蛋白表达水平。发现,Hsp20、Hsp27、Hsp90表达没有变化而Hsp70在热休克2h后上调,3h后达峰值。　　 HSP70是亚基分子量为70KD,考虑其到分子量较大,我们猜想其合成需一定时间,故我们探讨了热休克后不同的孵育时间对Hsp70表达的影响。结果让我们惊奇,我们发现热休克14 h后Hsp70显著上调(热休克处理3h组较非热休克组上调达14倍),并持续到24h。　　 2.热休克促进干细胞在糖氧剥夺模型中的存活,保护效应由Hsp70介导:将热休克处理并孵育14小时的细胞进行糖氧剥夺处理(Oxigen GlucoseDeprivation,OGD),通过LDH及TUNEL动态观察细胞死亡变化,发现OGD后8h,非热休克处理组细胞死亡显著增加(～40％),而HS-3h组细胞死亡减少(～20％)。随后我们用流式细胞术行 Annexin-Ⅴ检测,进一步确认了这一变化。充分说明热休克能促进干细胞存活。当用小分子干扰RNA敲低Hsp70表达后,热休克的保护效应显著降低,说明Hsp70为介导热休克促进干细胞存活的关键分子。　　 3.Akt促进HSF1向细胞核转位:热休克显著促进Hsp70上调,那么上调的机理是什么?我们在同一张膜上检测了两个常见的影响细胞存活信号分子Akt和ERK的磷酸化情况,发现Hsp70上调的同时Akt的磷酸化(ser-473)显著增强而ERK没有变化。而在行热休克前加入PI3K抑制剂LY294002(40μM)能显著抑制热休克诱导的Hsp70表达(与ERK抑制剂组和DMGO组相比)。因而确定Akt为调控Hsp70诱导表达的关键分子。　　 大量的研究报道在被热刺激所激活后,在细胞浆中的热休克因子1(HeatShock Factor1,HSF1)进入细胞核,与Hsp70的启动子结合,直接促进Hsp70转录。我们因而猜想Akt是否通过促进HSF1转位而诱导Hsp70表达?WesternBlot结果显示,热休克前胞浆HSF1高度富集而细胞核含量较少,热休克后却恰恰相反,胞浆HSF1含量显著减少而细胞核内高度富集,而同时公认的HSF1抑制物GSK-3β的活化受到抑制。而当加入PI3K抑制剂LY294002(40μM)时,HS目的这种转位被显著抑制。而同时GSK-3β的抑制物重新活化。因而Akt通过抑制GSK-3β进而促进HSF1向细胞核转位。　　 4.miR-34a为靶向Hsp70的microRNA:除了HSF1直接激活Hsp70引起Hsp70上调外,那么是否存在转录水平以外机制导致Hsp70表达上调?近年来发现microRNA在转录后水平影响蛋白翻译,进而减少蛋白合成。生物信息学的分析预测miR-34a可能是靶向Hsp70的microRNA,我们其后展开了miR-34a与Hsp70的靶标确认工作。包括:gain-of-function,loss-of-function以及报告基因荧光素酶活性检测。Gain-of-function的结果发现转染miR-34a mimic(模拟物),Hsp70蛋白表达较negative control和native(不转染)显著下调。而loss-of-function显示转染miR-34a锁核苷酸抑制剂(LNA inhibitor)Hsp70表达较negative control和native(不转染)相比Hsp70蛋白表达显著上调。Gain-of-function和loss—of-function的结果强烈提示miR-34a为调控Hsp70的microRNA,但Hsp70是否为miR-34a的直接靶标尚需荧光素酶报告基因验证。于是我们构建了Hsp703UTR荧光素酶报告基因载体并分别将miR-34a mimic及阴性对照miR negative control与Hsp703UTR荧光素酶报告基因载体共转染,48小时后裂解细胞并检测荧光强度。结果显示,Hsp703UTR luciferase reporter+miR-34a mimic组的荧光表达强度相对与对照组显著降低,说明miR-34a对Hsp70的3’UTR有较强的结合作用,能抑制萤火虫荧光素酶的表达。miR-34a为直接靶向Hsp70的microRNA。　　 5.HSF1能抑制miR-34a表达,间接促进Hsp70上调:既然miR-34a能抑制Hsp70的表达。一个很自然想到的问题是其在热休克模型中的内源性表达情况如何?我们通过Q-PCR检测发现,行热休克处理后miR-34a显著下调达70％。那么miR-34a下调的原因是什么?而现今认为DNA甲基化和组蛋白修饰是导致microRNA下调的重要原因。而我们用重亚硫酸盐检测方法检测DNA甲基化,发现热休克后miR-34a启动子上DNA甲基化未发生显著改变,而染色质免疫共沉淀(ChIP)结果则显示染色质打开的一个重要标记组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)在miR-34a启动子上的修饰明显减少,而染色质关闭的一个重要标记组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)在miR-34a启动子上的修饰明显增强,而同时启动miR-34a转录的RNA聚合酶Ⅱ在miR-34a启动子上的富集显著减少。说明组蛋白修饰,尤其是H3K27me3修饰增强是导致miR-34a下调的重要原因。而既往研究表明H3K27me3修饰增强是由于转录因子结合在启动子上招募一系列表观调控因子导致这一修饰改变。那么miR-34a究竟结合了什么转录因子抑制了其转录?　　 有趣的是,我们通过生物信息学分析发现miR-34a启动子上存在HSF1结合位点。我们立即进行ChIP实验,确认了miR-34a启动子上的确存在HSF1结合,且热休克后HSF1在miR-34a启动子的富集显著增强。之后,我们用小分子干扰RNA敲低HSF1表达时发现miR-34a能显著上调。以上实验说明HSF1很可能通过在miR-34a启动子上富集,引起抑制H3K27me3修饰增强,使maR-34a启动子周围的染色质关闭,转录下调,从而引起miR-34a表达降低。　　 6.细胞色素C氧化酶亚单位4(Cox-Ⅳ)为新发现的Hsp70结合蛋白:尽管发现了Hsp70为介导热休克效应的关键分子,但Hsp70作为分子伴侣,其最终的功能是要确保蛋白在应激情况下正确折叠或免遭降解。那么在我们确立的对干细胞有保护效应的热休克模型中,Hsp70要保护的蛋白是什么?　　 首先利用蛋白组学技术寻求与Hsp70相互作用蛋白,试图回答这一问题。我们的策略是首先进行免疫共沉淀,把跟Hsp70结合的蛋白尽可能pull down下来,然后进行质谱鉴定。实验准备了两组细胞,一组细胞给予热休克刺激(HS3h-incu14h),另一组细胞不给予热休克刺激(HSOh-incu14h),然后两组细胞均给予亚致死量刺激(OGD4h)后收集蛋白,进行免疫共沉淀(抗Hsp70抗体沉淀)。然后对产物进行还原,烷基化,胰蛋白酶消化后进行高效液相色谱二级串联质谱分析(LC-MS/MS),并对肽序列进行测序鉴定。所鉴定的肽序列中,有2段跟Cox-Ⅳ完全匹配。而免疫荧光发现Cox-Ⅳ与Hsp70存在共定位现象。生物信息学预测也发现Hsp70存在两个高度同源的结构域,提示Cox-Ⅳ可能为新发现的Hsp70结合蛋白。最后,我们再次进行免疫共沉淀实验(抗Hsp70抗体),发现Hsp70抗体能有效捕获Hsp70,而normal IgG却不能捕获Hsp70,说明了我们进行免疫共沉淀的抗体具有特异性。并且在热休克组中,利用抗Hsp70的抗体pull down下来的产物能同时检测到Cox-Ⅳ,而在非热休克处理组中不存在(结果与质谱分析结果一致)。这些结果充分说明Cox-Ⅳ为新发现的Hsp70结合蛋白。　　 那么Hsp70对Cox-Ⅳ是否有保护作用?我们首先检测了OGD4h后热休克组和非热休克组的表达情况。发现热休克组Cox-Ⅳ组表达显著较非热休克组上调。而敲低Hsp70表达能下调Cox-Ⅳ的表达。说明Hsp70对Cox-Ⅳ能调控Cox-Ⅳ表达。　　 [结论]　　 1.热休克促进骨髓来源Sca-1干细胞存活；　　 2.热休克的保护效应通过上调Hsp70介导;　　 3.miR-34a为直接调控Hsp70的microRNA。HSF1通过在miR-34a启动子上富集,增强组蛋白H3K27me3修饰,抑制miR3-34a转录,间接上调Hsp70蛋白表达；　　 4.Hsp70通过与CoxⅣ相互作用,保护CoxⅣ在OGD情况下免遭降解。　　 本课题的研究结果为细胞移植治疗心肌梗死过程中提高干细胞的存活效率,揭示了一个崭新的作用机制与潜在的治疗靶点。