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子宫内膜癌(Endometrial carcinoma,EC)是最常见的威胁女性生命的生殖系统恶性肿瘤。早期子宫内膜癌预后较好,但一旦发生转移和复发,无论何种病理类型及分期均会导致较差的预后。近年来,子宫内膜癌的发病率在全世界范围内呈上升趋势,因此,探索有效的肿瘤标志物对子宫内膜癌早期诊断及治疗方案制定有着重要的意义。
根据人类基因组研究计划报道,96%的以上基因是非编码基因以及非编码基因的产物即非编码RNA,根据转录长度,非编码RNA分为长链非编码RNA(lncRNA和circleRNA等)和小RNA(MicroRNA和snoRNA等)。LncRNASNHG5是核仁小分子非编码RNA(Small nucleolar RNA, snoRNA)宿主基因家族成员之一,其长度为524个碱基对,定位于6q15染色体易位的断裂点。非编码RNA已经被证实有非常重要的生物调节功能。然而,SNHG5在子宫内膜癌的表达及临床意义仍不清楚。本课题旨在研究SNHG5在子宫内膜癌中的表达情况及功能,并进一步研究SNHG5可能通过miR-25-3p/BTG2轴调节内膜癌进展的机制。本研究由以下三部分构成:
第一部分SNHG5在子宫内膜癌细胞及组织中的表达
目的:检测SNHG5在子宫内膜癌细胞及组织中的表达,评价其在疾病发展中的作用。
方法:RT-qPCR方法检测子宫内膜癌细胞及组织中SNHG5表达水平,应用TRIzol试剂盒提取细胞或组织中的总RNA,按试剂盒说明书操作进行SNHG5相对表达量的检测。
结果:
1.SNHG5在细胞中的表达水平
两组子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1-B中SNHG5相对表达水平明显低于正常子宫内膜细胞ESC表达水平,两者相比具有明显的统计学差异,P<0.01。
2.SNHG5在组织中的表达水平
癌组织中的相对表达水平明显低于癌旁组织,两者相比具有明显统计学差异,P<0.01。
结论:
SNHG5在子宫内膜癌细胞及组织中的相对表达量明显降低,可能与内膜癌疾病的发生发展呈负相关关系。
第二部分SNHG5对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响
目的:验证SNHG5对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭、迁移生物学功能的影响,评估其在内膜癌发病过程中发挥作用的途径。
方法:
1.细胞培养、转染及检测
子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B在DMEM培养液中培养。使用RNAiMax和脂质体LTX与PlusReagent(Thermo Fisher Scientific)试剂将SNHG5质粒转染至KLE和HEC-1-B细胞系中形成过表达细胞系,RNAi转染敲低SNHG5形成敲低表达细胞系,应用RT-qPCR方法检测并评价两细胞系是否转染成功。
2.细胞增殖实验
应用MTS方法检测过表达和敲低表达SNHG5对子宫内膜癌细胞KLE、HEC-1-B增殖水平的改变。
3.Transwell迁移实验
应用Transwell迁移实验检测过表达和敲低表达SNHG5对子宫内膜癌细胞KLE、HEC-1-B迁移水平的改变。
4.基质胶侵袭实验
应用MatrigelTranswell侵袭实验检测过表达和敲低表达SNHG5对子宫内膜癌细胞KLE、HEC-1-B侵袭水平的改变。
结果:
1.转染后两种细胞中SNHG5表达水平检测
通过过表达和敲低表达SNHG5后分成五组:过表达对照组(CD511B)、SNHG5过表达组(SNHG5)、敲低表达对照组(si-NC)、敲低表达组1(si-1)、敲低表达组2(si-2)。PCR结果通过与相应各组比较,证实过表达或敲低表达成功,P<0.01。
2.SNHG5对子宫内膜癌细胞增殖的影响
MTS检测结果显示:在两种子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中,与对照组相比,过表达SNHG5能够明显抑制细胞增殖,敲低表达SNHG5能够明显促进细胞增殖,P<0.01。
3.SNHG5对子宫内膜癌细胞迁移的影响
Transwell实验结果显示:在两种子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中,与对照组相比,过表达SNHG5能够明显抑制细胞迁移,敲低表达SNHG5能够明显促进细胞迁移,P<0.01。
4.SNHG5对子宫内膜癌细胞侵袭的影响
MatrigelTranswell结果显示:在两种子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中,与对照组相比,过表达SNHG5能够明显抑制细胞KLE和HEC-1-B侵袭能力,敲低表达SNHG5能够明显促进KLE和HEC-1-B细胞侵袭能力,P<0.01。
结论:过表达SNHG5能够抑制子宫内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系的增殖、侵袭、迁移,敲低表达SNHG5能够促进KLE和HEC-1-B细胞系的增殖、侵袭、迁移,SNHG5是子宫内膜癌的抑癌基因并通过抑制细胞功能发挥作用。
第三部分SNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴调节子宫内膜癌进展的机制研究
目的:阐述SNHG5通过竞争抑制miR-25-3p进而作用于靶基因BTG2抑制子宫内膜癌疾病的进展。
方法:
1预测并评估SNHG5竞争抑制性microRNAs
检索starBase,v2.0数据库,预测miR-25-3p为SNHG5竞争抑制性miRNA。在子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1-B中过表达或者敲低表达SNHG5,应用RT-qPCR方法检测不同组子宫内膜癌细胞中miR-25-3p的表达水平,明确SNHG5与miR-25-3p之间的相互影响。
2RT-qPCR方法检测miR-25-3p在子宫内膜癌组织中的表达,验证miR-25-3p对细胞增殖、迁移、侵袭生物学功能的影响。
3验证子宫内膜癌细胞中过表达miR-25-3p是否能影响SNHG5的功能
3.1RT-qPCR方法检测过表达或敲低表达SNHG5在内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系中miR-25-3p的相对表达量。
3.2将miR-25-3pmimic转染到SNHG5过表达细胞系KLE和HEC-1-B中,转染后分为五组,过表达SNHG5对照CD511-B组(CD511-B组)、SNHG5过表达组(SNHG5组)、miR-25-3p转染对照组mimiccontrol组(mimiccontrol组)、mimicmiR-25-3p组和SNHG5+miR-25-3p共过表达组(SNHG5+miR-25-3p组),转染后细胞培养,然后应用MTS方法行细胞增殖功能测定、Transwell实验方法行细胞迁移功能测定、基质胶侵袭实验方法行细胞侵袭功能测定。
4预测miR-25-3p的靶基因为BTG2
4.1双荧光素酶实验检测miR-25-3p对基因BTG2的靶向作用。
4.2Western-blot方法检测过表达miR-25-3p后BTG2蛋白表达水平。
5验证SNHG5可能通过互补结合miR-25-3p竞争性促进BTG2的表达水平
5.1将SNHG5过表达质粒以及SNHG5与miR-25-3pmimics共转染至子宫内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系,利用RT-qPCR方法检测BTG2基因的表达水平。
5.2将SNHG5过表达质粒以及SNHG5与miR-25-3pmimics共转染至子宫内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系,应用western-blot方法检测BTG2的蛋白表达水平。
6SNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴作用的临床意义
6.1RT-qPCR方法检测子宫内膜癌及癌旁组织中BTG2的表达水平,并将SNHG5、miR-25-3p和BTG2三者在子宫内膜癌组织中表达水平做相关性分析。
6.2用免疫组化方法分别检测98例子宫内膜癌患者(实验组)和80例子宫内膜良性病变患者组织(对照组)中BTG2蛋白表达水平,比较两组之间的差异。
6.3根据BTG2蛋白表达水平并分为两组:低表达组,弱表达(+)和中表达(++);高表达组,强表达(+++),分析BTG2蛋白表达水平与临床病理的关系。
结果:
1预测SNHG5竞争抑制性miRNA为miR-25-3p
RT-qPCR方法检测在SNHG5过表达和敲低表达后在KLE和HEC-1-B中miR-25-3p的表达水平,确定SNHG5的竞争抑制性miRNA为miR-25-3p。
2miR-25-3p在子宫内膜癌组织中表达及对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学功能的作用结果
2.1RT-qPCR方法检测癌组织中miR-25-3p表达水平明显高于癌旁组,两者相比具有明显统计学差异,P<0.01。
2.2过表达miR-25-3p能促进KLE和HEC-1-B细胞的增殖、迁移及侵袭。
3过表达miR-25-3p部分恢复SNHG5对子宫内膜癌细胞生物学功能的抑制作用
3.1RT-qPCR结果显示:与对照组(CD511B)相比,过表达SNHG5的KLE和HEC-1-B细胞系miR-25-3p表达水平显著降低,两者相比有明显的统计学差异,P<0.01;与对照组(si-NC)相比,敲低表达SNHG5的KLE和HEC-1-B细胞系miR-25-3p表达水平显著升高,两者相比有明显的统计学差异,P<0.01。
3.2miR-25-3pmimic转染到SNHG5过表达细胞系KLE和HEC-1-B后,过表达miR-25-3p部分恢复SNHG5对两种细胞系的增殖、迁移、侵袭的抑制作用,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
4miR-25-3p的靶基因为BTG2
4.1通过查找targetscan网站(http://www.targetscan.org)初步预测miR-25-3p靶基因为BTG2。
4.2双荧光素酶报告基因分析结果
荧光素酶结果显示:miR-25-3p转染组BTG2的相对荧光强度显著低于mimicsNC转染组,而BTG2的3’UTR中的miR-25-3p结合位点发生突变后,miR-25-3p转染组和mimicsNC转染组的相对荧光强度无明显差异,表明miR-25-3p过表达对报告基因的抑制作用消除,P<0.01。
4.3Western-blot进一步核实miR-25-3p的靶基因为BTG2
Western-blot结果显示:过表达miR-25-3p内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中BTG2的蛋白表达水平较未转染的明显降低,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
5SNHG5可能通过互补结合miR-25-3p,竞争性促进BTG2的表达水平
5.1RT-qPCR结果显示:SNHG5过表达的两种细胞系BTG2水平增高,而SNHG5和miR-25-3p共过表达的两种细胞系能使增高的BTG2水平得到降低,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
5.2Western-blot结果显示SNHG5过表达质粒的两种细胞系BTG2蛋白表达水平增高,而SNHG5和miR-25-3p共表达的两种细胞系能使增高的BTG2蛋白表达水平得到降低,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
6SNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴发挥作用的临床意义
6.1RT-qPCR检测40对癌和癌旁组织中BTG2表达水平,结果显示BTG2表达水平在癌组织中呈明显降低,P<0.01;SNHG5在子宫内膜癌组织表达水平与miR-25-3p呈明显负相关r=-0.369,P=0.019,与BTG2水平呈正相关r=0.376,P=0.017。
6.2免疫组织化学实验结果
免疫组化结果显示实验组:低表达78例,高表达20例;对照组中:低表达24例,高表达56例,两组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。6.3在98例癌组织中,BTG2蛋白表达水平与临床分期、组织分级、淋巴血管浸润、淋巴转移相关,与年龄、肌层浸润深度、组织类型无关,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
结论:LncRNASNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴调节子宫内膜癌进展,lncRNASNHG5/miR-25-3p/BTG2轴在子宫内膜癌发生发展中发挥着重要作用。
根据人类基因组研究计划报道,96%的以上基因是非编码基因以及非编码基因的产物即非编码RNA,根据转录长度,非编码RNA分为长链非编码RNA(lncRNA和circleRNA等)和小RNA(MicroRNA和snoRNA等)。LncRNASNHG5是核仁小分子非编码RNA(Small nucleolar RNA, snoRNA)宿主基因家族成员之一,其长度为524个碱基对,定位于6q15染色体易位的断裂点。非编码RNA已经被证实有非常重要的生物调节功能。然而,SNHG5在子宫内膜癌的表达及临床意义仍不清楚。本课题旨在研究SNHG5在子宫内膜癌中的表达情况及功能,并进一步研究SNHG5可能通过miR-25-3p/BTG2轴调节内膜癌进展的机制。本研究由以下三部分构成:
第一部分SNHG5在子宫内膜癌细胞及组织中的表达
目的:检测SNHG5在子宫内膜癌细胞及组织中的表达,评价其在疾病发展中的作用。
方法:RT-qPCR方法检测子宫内膜癌细胞及组织中SNHG5表达水平,应用TRIzol试剂盒提取细胞或组织中的总RNA,按试剂盒说明书操作进行SNHG5相对表达量的检测。
结果:
1.SNHG5在细胞中的表达水平
两组子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1-B中SNHG5相对表达水平明显低于正常子宫内膜细胞ESC表达水平,两者相比具有明显的统计学差异,P<0.01。
2.SNHG5在组织中的表达水平
癌组织中的相对表达水平明显低于癌旁组织,两者相比具有明显统计学差异,P<0.01。
结论:
SNHG5在子宫内膜癌细胞及组织中的相对表达量明显降低,可能与内膜癌疾病的发生发展呈负相关关系。
第二部分SNHG5对子宫内膜癌细胞生物学功能的影响
目的:验证SNHG5对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭、迁移生物学功能的影响,评估其在内膜癌发病过程中发挥作用的途径。
方法:
1.细胞培养、转染及检测
子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B在DMEM培养液中培养。使用RNAiMax和脂质体LTX与PlusReagent(Thermo Fisher Scientific)试剂将SNHG5质粒转染至KLE和HEC-1-B细胞系中形成过表达细胞系,RNAi转染敲低SNHG5形成敲低表达细胞系,应用RT-qPCR方法检测并评价两细胞系是否转染成功。
2.细胞增殖实验
应用MTS方法检测过表达和敲低表达SNHG5对子宫内膜癌细胞KLE、HEC-1-B增殖水平的改变。
3.Transwell迁移实验
应用Transwell迁移实验检测过表达和敲低表达SNHG5对子宫内膜癌细胞KLE、HEC-1-B迁移水平的改变。
4.基质胶侵袭实验
应用MatrigelTranswell侵袭实验检测过表达和敲低表达SNHG5对子宫内膜癌细胞KLE、HEC-1-B侵袭水平的改变。
结果:
1.转染后两种细胞中SNHG5表达水平检测
通过过表达和敲低表达SNHG5后分成五组:过表达对照组(CD511B)、SNHG5过表达组(SNHG5)、敲低表达对照组(si-NC)、敲低表达组1(si-1)、敲低表达组2(si-2)。PCR结果通过与相应各组比较,证实过表达或敲低表达成功,P<0.01。
2.SNHG5对子宫内膜癌细胞增殖的影响
MTS检测结果显示:在两种子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中,与对照组相比,过表达SNHG5能够明显抑制细胞增殖,敲低表达SNHG5能够明显促进细胞增殖,P<0.01。
3.SNHG5对子宫内膜癌细胞迁移的影响
Transwell实验结果显示:在两种子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中,与对照组相比,过表达SNHG5能够明显抑制细胞迁移,敲低表达SNHG5能够明显促进细胞迁移,P<0.01。
4.SNHG5对子宫内膜癌细胞侵袭的影响
MatrigelTranswell结果显示:在两种子宫内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中,与对照组相比,过表达SNHG5能够明显抑制细胞KLE和HEC-1-B侵袭能力,敲低表达SNHG5能够明显促进KLE和HEC-1-B细胞侵袭能力,P<0.01。
结论:过表达SNHG5能够抑制子宫内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系的增殖、侵袭、迁移,敲低表达SNHG5能够促进KLE和HEC-1-B细胞系的增殖、侵袭、迁移,SNHG5是子宫内膜癌的抑癌基因并通过抑制细胞功能发挥作用。
第三部分SNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴调节子宫内膜癌进展的机制研究
目的:阐述SNHG5通过竞争抑制miR-25-3p进而作用于靶基因BTG2抑制子宫内膜癌疾病的进展。
方法:
1预测并评估SNHG5竞争抑制性microRNAs
检索starBase,v2.0数据库,预测miR-25-3p为SNHG5竞争抑制性miRNA。在子宫内膜癌细胞KLE和HEC-1-B中过表达或者敲低表达SNHG5,应用RT-qPCR方法检测不同组子宫内膜癌细胞中miR-25-3p的表达水平,明确SNHG5与miR-25-3p之间的相互影响。
2RT-qPCR方法检测miR-25-3p在子宫内膜癌组织中的表达,验证miR-25-3p对细胞增殖、迁移、侵袭生物学功能的影响。
3验证子宫内膜癌细胞中过表达miR-25-3p是否能影响SNHG5的功能
3.1RT-qPCR方法检测过表达或敲低表达SNHG5在内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系中miR-25-3p的相对表达量。
3.2将miR-25-3pmimic转染到SNHG5过表达细胞系KLE和HEC-1-B中,转染后分为五组,过表达SNHG5对照CD511-B组(CD511-B组)、SNHG5过表达组(SNHG5组)、miR-25-3p转染对照组mimiccontrol组(mimiccontrol组)、mimicmiR-25-3p组和SNHG5+miR-25-3p共过表达组(SNHG5+miR-25-3p组),转染后细胞培养,然后应用MTS方法行细胞增殖功能测定、Transwell实验方法行细胞迁移功能测定、基质胶侵袭实验方法行细胞侵袭功能测定。
4预测miR-25-3p的靶基因为BTG2
4.1双荧光素酶实验检测miR-25-3p对基因BTG2的靶向作用。
4.2Western-blot方法检测过表达miR-25-3p后BTG2蛋白表达水平。
5验证SNHG5可能通过互补结合miR-25-3p竞争性促进BTG2的表达水平
5.1将SNHG5过表达质粒以及SNHG5与miR-25-3pmimics共转染至子宫内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系,利用RT-qPCR方法检测BTG2基因的表达水平。
5.2将SNHG5过表达质粒以及SNHG5与miR-25-3pmimics共转染至子宫内膜癌KLE和HEC-1-B细胞系,应用western-blot方法检测BTG2的蛋白表达水平。
6SNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴作用的临床意义
6.1RT-qPCR方法检测子宫内膜癌及癌旁组织中BTG2的表达水平,并将SNHG5、miR-25-3p和BTG2三者在子宫内膜癌组织中表达水平做相关性分析。
6.2用免疫组化方法分别检测98例子宫内膜癌患者(实验组)和80例子宫内膜良性病变患者组织(对照组)中BTG2蛋白表达水平,比较两组之间的差异。
6.3根据BTG2蛋白表达水平并分为两组:低表达组,弱表达(+)和中表达(++);高表达组,强表达(+++),分析BTG2蛋白表达水平与临床病理的关系。
结果:
1预测SNHG5竞争抑制性miRNA为miR-25-3p
RT-qPCR方法检测在SNHG5过表达和敲低表达后在KLE和HEC-1-B中miR-25-3p的表达水平,确定SNHG5的竞争抑制性miRNA为miR-25-3p。
2miR-25-3p在子宫内膜癌组织中表达及对子宫内膜癌细胞增殖、迁移、侵袭生物学功能的作用结果
2.1RT-qPCR方法检测癌组织中miR-25-3p表达水平明显高于癌旁组,两者相比具有明显统计学差异,P<0.01。
2.2过表达miR-25-3p能促进KLE和HEC-1-B细胞的增殖、迁移及侵袭。
3过表达miR-25-3p部分恢复SNHG5对子宫内膜癌细胞生物学功能的抑制作用
3.1RT-qPCR结果显示:与对照组(CD511B)相比,过表达SNHG5的KLE和HEC-1-B细胞系miR-25-3p表达水平显著降低,两者相比有明显的统计学差异,P<0.01;与对照组(si-NC)相比,敲低表达SNHG5的KLE和HEC-1-B细胞系miR-25-3p表达水平显著升高,两者相比有明显的统计学差异,P<0.01。
3.2miR-25-3pmimic转染到SNHG5过表达细胞系KLE和HEC-1-B后,过表达miR-25-3p部分恢复SNHG5对两种细胞系的增殖、迁移、侵袭的抑制作用,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
4miR-25-3p的靶基因为BTG2
4.1通过查找targetscan网站(http://www.targetscan.org)初步预测miR-25-3p靶基因为BTG2。
4.2双荧光素酶报告基因分析结果
荧光素酶结果显示:miR-25-3p转染组BTG2的相对荧光强度显著低于mimicsNC转染组,而BTG2的3’UTR中的miR-25-3p结合位点发生突变后,miR-25-3p转染组和mimicsNC转染组的相对荧光强度无明显差异,表明miR-25-3p过表达对报告基因的抑制作用消除,P<0.01。
4.3Western-blot进一步核实miR-25-3p的靶基因为BTG2
Western-blot结果显示:过表达miR-25-3p内膜癌细胞系KLE和HEC-1-B中BTG2的蛋白表达水平较未转染的明显降低,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
5SNHG5可能通过互补结合miR-25-3p,竞争性促进BTG2的表达水平
5.1RT-qPCR结果显示:SNHG5过表达的两种细胞系BTG2水平增高,而SNHG5和miR-25-3p共过表达的两种细胞系能使增高的BTG2水平得到降低,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
5.2Western-blot结果显示SNHG5过表达质粒的两种细胞系BTG2蛋白表达水平增高,而SNHG5和miR-25-3p共表达的两种细胞系能使增高的BTG2蛋白表达水平得到降低,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
6SNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴发挥作用的临床意义
6.1RT-qPCR检测40对癌和癌旁组织中BTG2表达水平,结果显示BTG2表达水平在癌组织中呈明显降低,P<0.01;SNHG5在子宫内膜癌组织表达水平与miR-25-3p呈明显负相关r=-0.369,P=0.019,与BTG2水平呈正相关r=0.376,P=0.017。
6.2免疫组织化学实验结果
免疫组化结果显示实验组:低表达78例,高表达20例;对照组中:低表达24例,高表达56例,两组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。6.3在98例癌组织中,BTG2蛋白表达水平与临床分期、组织分级、淋巴血管浸润、淋巴转移相关,与年龄、肌层浸润深度、组织类型无关,各组比较具有明显的统计学差异,P<0.01。
结论:LncRNASNHG5通过miR-25-3p/BTG2轴调节子宫内膜癌进展,lncRNASNHG5/miR-25-3p/BTG2轴在子宫内膜癌发生发展中发挥着重要作用。