两株鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

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鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎(Duck infectious serositis),是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一种主要侵害鸭的细菌性传染病,该病发病率、死亡率都很高,严重影响全球养鸭业的经济效益。2013年7月和2014年4月安徽省内两鹅养殖场先后爆发雏鹅急性死亡的病例,患病雏鹅出现拉白色或绿色拉稀、脚掌发黄无血色、头颈扭曲震颤、共济失调等症状,甚至有部分病鹅未表现症状就急性死亡。对病死雏鹅剖检可见心脏、肝脏覆盖纤维素性渗出物,脑膜严重出血。根据临床的表现和剖检所见病理变化初步怀疑为鸭疫里默氏杆菌病。从患病雏鹅的脑部取样进行细菌分离,获得的单个菌落直径约1mm,凸起,湿润,光滑,呈露珠状,镜检为革兰氏染色阴性短小杆菌。通过使用PCR方法扩增分离菌株的16S rRNA后进行测序,序列比对结果显示,两株分离菌株与鸭疫里默氏杆菌同源性为99%,证实引起这两起雏鹅急性死亡疫病的病原菌为RA,分别命名为LAG1株和HFG1株。两株RA分离株的生化特性试验结果一致,二者均为触酶试验结果和脲酶试验结果阳性,不还原硝酸盐,不能液化明胶,多种糖微量反应试验、醇酵解试验、V-P试验、MR试验、吲哚试验结果均为阴性。通过血清凝集试验鉴定这两株鹅源RA均为血清15型。根据RA ompA基因序列的保守区设计引物,建立检测RA的PCR方法,敏感性试验表明所建立的PCR检测方法可检出213ng的RA的DNA。对抗生素的耐药性检测结果表明LAG1株和HFG1株RA对β-内酰胺类药物(d>18mm),四环素类药物(d>16mm),大环内酯类药物高度敏感(d>23mm);对氯霉素中度敏感(17mm>d>13mm);对氨基糖苷类药物耐药(d<11mm)。LAG1和HFG1对不良环境的抵抗力略有不同,在酸性条件下HFG1的耐受能力较强,而在碱性条件下LAG1的耐受力较强;在抵抗氧化剂方面H2O2对LAG1和HFG1的最小杀菌浓度(MBC)分别为40mM和20mM;在抵抗洗涤剂TritonX-100对LAG1和HFG1的最小杀菌浓度(MBC)均为0.004%。采用10倍倍比稀释的方法将菌液计数并稀释到含菌量为109、108、107、106、105、104和103CFU/mL的7个稀释度,采用腿部肌肉注射的方法攻毒7日龄樱桃谷鸭,测定LAG1和HFG1的半数致死量(LD50),结果显示:LAG1株的LD50为7.75×103CFU;HFG1株的LD50为5.91×105CFU。将这两株RA分别制备油乳剂灭活苗免疫樱桃谷鸭测定其对血清1型WJ4、血清2型Yb2、血清10型HXb2及原菌株的免疫保护效率,结果显示LAG1株制备的灭活油乳剂疫苗在二次免疫14d后,对原菌株和10型HXb2的攻击可以提供较高的保护,保护率分别可以达到85.7%(6/7)和71.43%(5/7),对血清1型WJ4、血清2型Yb2攻击的保护率很低均为14.2%(1/7);。使用HFG1株所制备的灭活油乳剂疫苗对原菌株具有很好的保护率为85.7%(6/7),对血清10型HXb2的保护力欠佳,为和57.14%(4/7)。对血清1型WJ4无保护力,对血清2型Yb2的保护率仅为14.2%(1/7)。结果对RA疫苗的研制提供一定的指导意义。
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