五氯酚(PCP)和六氯苯(HCB)是典型的持久性有机污染物,具有致畸、致癌、致突变性质,严重地威胁着人类身体健康。尽管二者在环境中化学性质很稳定,但仍然可以降解生成其他代谢产物。六氯苯可以通过细胞色素P450途径代谢生成具有活性的四氯苯醌(TCBQ)和四氯氢醌(TCHQ),五氯酚则可以通过鞘氨醇杆菌代谢为四氯苯醌,然后进一步还原成四氯氢醌。在这些代谢过程中会产生大量ROS,破坏生物体内的氧化还原平衡,导致毒性效应的发生,如遗传毒性、肝毒性、免疫毒性、神经毒性等。随着人口老龄化现象地加重,许多神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森等疾病的患病率也逐渐增高。引起这些疾病的因素很多,包括环境、基因及老龄化等相关内源性因素,但基本可以概括为由于氧化应激的产生导致的神经炎症形成。近几年来,关于六氯苯和五氯酚的神经毒性研究已经很多,但是关于四氯苯醌的神经毒性,特别是炎症病理机制的研究资料却很少见。探讨四氯苯醌诱导PC12细胞炎症反应的机制,可以为有关神经系统疾病的预防和治疗提供新思路。因此,本文选用PC12细胞作为研究对象,设想它引起的炎症毒性与ROS的产生有关,做了以下两部分实验。(一)四氯苯醌激活IKK/IκB/NF-κB信号通路的机制研究本实验旨在比较六氯苯、五氯酚、四氯氢醌和四氯苯醌四种化合物对PC12细胞的细胞毒性、ROS产量、促炎症因子表达的作用,然后进一步探讨四氯苯醌激活NF-κB信号通路的机制。首先利用CCK-8实验,比较了四种化合物在不同浓度、不同时间条件下的细胞毒性,结果发现四种化合物的细胞毒性呈现时间和浓度依赖性增加,并且与ROS的形成密切相关,其中TCBQ和TCHQ毒性强于pcp、hcb。从dcfh-da探针检测ros水平及免疫印迹检测促炎症因子表达的实验结果中发现tcbq和tchq对ros和促炎症因子的诱导作用强于hcb和pcp。接着用免疫印迹和rt-qpcr实验手段从浓度梯度上考察了四氯苯醌诱导ikk/iκb/nf-κb信号通路相关炎症蛋白的表达情况及促炎症因子的mrna水平,及采用nf-κb特异性抑制剂pdtc考察了tcbq诱导nf-κb核转录活性。实验结果显示tcbq可以诱导nf-κb信号通路中相关蛋白表达,还可以提高促炎症因子的mrna水平,pdtc则明显抑制tcbq诱导的nf-κb核转录及其与目的基因结合的活性。抗氧化剂nac、维生素e和姜黄素可以清除tcbq作用细胞产生的ros,还可以部分抑制ikk/iκb/nf-κb信号通路中相关蛋白表达,这说明ros在ikk/iκb/nf-κb信号通路的活化中扮演着重要角色。(二)褪黑素拮抗四氯苯醌激活hmgb1/tlr4/myd88信号通路的机制研究四氯苯醌的促炎、促氧化作用在第一部分实验中已经得到证实;关于hmgb1/tlr4/myd88在炎症研究中的重要性,很多文献都有介绍;褪黑素是松果体分泌的一种激素,为强大的内源性抗氧化剂,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用。基于以上三点,本实验把tcbq、褪黑素、hmgb1/tlr4/myd88三者联系起来,对它们的相互作用机制进行了探讨。首先利用cck-8实验筛选了褪黑素减缓tcbq细胞毒性的最适给药浓度,最终我们选用200μm褪黑素预处理细胞1h,再给予25μmtcbq培养细胞6h进行后面的实验研究。用免疫印迹实验、免疫共沉淀及rt-qpcr实验考察了tcbq对tlr4、md2、cd14、myd88的影响,还考察了褪黑素在这个过程中的作用,结果发现tcbq可以诱导tlr4、md2、cd14、myd88的蛋白表达,tlr4和myd88的mrna水平上升,及促进tlr4与其适配器md2、cd14、myd88的结合,然而褪黑素抑制了tlr4和其适配器的表达,还抑制了它们的相互结合作用。接着也考察了褪黑素对tcbq诱导的mapks活性的影响,及对下游炎症因子的表达情况,结果显示褪黑素可以逆转tcbq对mapks活性的诱导作用。用tlr4sirna、myd88sirna转染pc12细胞观察蛋白表达情况,用tlr4敲除的小鼠实验观察小鼠脑部切片的he染色、免疫组化和免疫荧光图,发现tcbq在tlr4和myd88基因缺陷的情况下,炎症损伤明显降低,这强调了tlr4信号途径在tcbq诱导的神经炎症中的重要作用。接着我们探讨了tcbq是如何激活tlr4信号通路的。通过免疫荧光、免疫印迹及免疫共沉淀实验,证明tcbq可以使hmgb1在细胞核内发生乙酰化和磷酸化修饰,随后进入细胞质,释放到培养基里。用免疫印迹、免疫荧光、rt-qpcr和免疫共沉淀实验考察了tcbq在hmgb1和其受体中的作用,结果发现tcbq可以诱导HMGB1及其受体(TLR2、TLR4、TLR9、RAGE)的表达,及促进HMGB1与其受体的结合,在这些受体中,HMGB1与TLR4的作用最强。接着通过蔗糖密度梯度分离实验,将裂解液分成12个片段,再利用免疫印迹实验证实TCBQ、HMGB1和LPS可以诱导TLR4/MD2向脂筏区域募集,褪黑素作为抗氧化剂跟NAC、脂筏抑制剂(β-环糊精和制霉菌素)显示相同的结果,这说明了ROS参与了TCBQ诱导TLR4向脂筏转运的过程。用HMGB1 si RNA转染PC12细胞,观察相关蛋白表达情况,发现褪黑素可以抑制HMGB1调控TCBQ诱导的TLR4信号途径。用TLR4基因敲除的小鼠,观察到TLR4基因缺陷可以保护TCBQ引起的小鼠脑损伤,同时还可以部分抑制HMGB1出核及释放。综合以上两部分实验,可得知四氯苯醌诱导神经炎症反应,主要是通过活性氧激活IKK/IκB/NF-κB信号通路和促进细胞内HMGB1释放,随后招募TLR4向脂筏区域转录。