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研究目的研究生物标志物P27、Skp2、CyclinD1、Ep-CAM、MUC1、Ki67及EGFR在胆囊癌的表达与其生物学特点,并探讨上述标志物及各种临床病理参数与患者生存时间的关系。寻找新的与胆囊癌预后相关的分子标记物,以期为临床提供更多的信息,指导治疗,减少复发与转移。研究方法本实验为回顾性研究:复习解放军总医院病理科1999年7月-2005年7月行手术切除的胆囊癌72例,查阅相关病历并对全部病例进行随访,得到临床资料齐全并成功荻访的病人共60例。光镜下复习60例胆囊癌病例病理切片,观察癌组织病理分类、分化程度、神经侵犯、血管侵犯及有无坏死等病理特点。免疫组化染色:采用PV6000二步法,检测60例胆囊癌及15例癌旁正常组织标本的P27、Skp2、CyclinD1、Ep-CAM、MUC1、Ki67及EGFR七种生物标志物表达状况,分析其与临床、病理及预后的关系。EGFR基因突变的检测:检出2003年7月-2007年7月间经免疫组化检测EGFR染色为阳性的胆囊癌病例20例,并查阅相关临床资料。提取胆囊癌石蜡标本的DNA,进行定量测定,并采用聚合酶链反应技术进行扩增反应,用扩增产物来进行纯化及测序分析,观察其EGFR基因第18、19、20及21外显子的突变情况。结果各生物标志物的在胆囊癌表达的阳性率分别为P27（41.7%）、Skp2（56.7%）、CyclinD1（48.3%）、Ep-CAM（56.7%）、MUC1（51.7%）、Ki67（55.0%）及EGFR（33.3%）。与Nevin分期相关的是P27及Skp2（p均＜0.05）,其中Skp2的表达在Ⅰ-Ⅲ期比Ⅳ一Ⅴ期高（P=0.016）,而P27则与之相反（P=0.037）。CyclinD1、Skp2、MUC1及Ki67随着病理组织分化程度的降低,其蛋白表达增高,在高分化组与中低分化组之间具有统计学差异（P均＜0.05）。另外,CyclinD1及Skp2均与坏死呈正相关（P均＜0.05）,含坏死组的阳性率均明显高于无坏死组的阳性率（P均＜0.05）。Skp2、CyclinD1、Ep-CAM、MUC1、Ki67及EGFR在胆囊癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,而P27则相反（P均＜0.05）。单因素生存分析显示,P27、Skp2、CyclinD1、Ep-CAM、Ki67、Nevin分期、肿瘤病理分化、肿瘤坏死、血管侵犯及手术方式共10种因素与胆囊癌患者的术后生存时间有关:P27阳性表达组患者的总体生存时间长于阴性的患者（P=0.000）;skp2、CyclinD1、Ep-CAM及Ki67阳性表达组患者的生存时间均较阴性表达组患者的生存时间短(Pskp2=0.003,PCyclinD1=0.016,PEp-CAM=0.038,PKi67=0.027);胆囊癌患者的Nevin分期（P=0.000）、肿瘤分化程度（P=0.021）、肿瘤有无坏死（P=0.033）、血管侵犯（P=0.044）、手术方式（P=0.000）均为影响预后的因素。最终Cox多因素总体生存分析显示,P27、Skp2及手术方式3种因素入选,P27阳性表达、Skp2阴性表达及采取根治手术的患者生存时间长,预后较好。序列分析的结果显示,在这20例胆囊癌中,有3例病例经过测序分析见其EGFR基因第20号外显子发生了错义突变,突变率为15%,其中一例发生两处错义突变,位点分别位于第803密码子2407破基处（CGG→TGG）和第805密码子2414碱基处（CAC→CGC）,氨基酸分别由精氨酸变成色氨酸（Arg→Trp）及谷氨酰胺变为精氨酸（Gln→Arg）。另外两例位点分别位于第792密码子2375碱基处（CTC→CCC）和第795密码子2383碱基处（TTC→CTC）,氨基酸分别由亮氨酸变成脯氨酸（Leu→Pro）及苯丙氨酸变为亮氨酸（Phe→Leu）。另有2例患者检测出EGFR基因发生了同义突变,一例见于第20号外显子,突变位点为第787密码子2361碱基处（Gin:CAG→CAA）,另一例同义突变位点为18号外显子第725密码子2175碱基处（Thr:ACG→ACA）。EGFR基因突变的病例均为Nevin分期Ⅴ期,在术后一年内均死亡。结论1、P27、Skp2及手术方式是胆囊癌生存时间的独立预后因子。2、P27、Skp2、CyclinD1、Ep-CAM、MUC1、Ki67及EGFR均与胆囊癌的发生有一定关系,上述生物标志物表达的变化可能对胆囊癌的演化和进展起重要作用,并可能成为新的临床辅助诊断和监测预后的指标。3、EGFR基因第18-21号外显子的突变可能与胆囊癌的进程及预后有关。