小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)细胞具有自我更新和多分化潜能,合适的微环境可使ES细胞体外分化成神经外胚层组织,进而定向分化为神经元和神经胶质细胞。ES细胞体外神经分化模型可模拟体内胚胎神经发育过程,通过活性小分子化合物体外干预ES细胞微环境,可以为设计和评价神经分化调控药物提供新的平台。同时该小分子作为探针可以发挥在不同时间、不同剂量和进行可逆操作方式的优势来检测特定蛋白的功能,从而探查发现ES细胞神经分化新的分子事件和信号通路,在基因(蛋白)功能研究、药物作用新靶标的发现与确证以及新药先导化合物的发现中具有巨大的潜力。利用小分子化合物深入阐明ES细胞神经分化机制,也为揭示体内神经系统分化发育网络和神经退行性疾病发病机理提供新的思路和理论依据。本课题前期研究发现一些天然8位异戊烯基取代黄酮类化合物,如淫羊藿素(icaritin, ICT)和异补骨脂甲素(isobavachin, IB A)具有促小鼠ES细胞神经分化作用。据此利用组合化学手段,建立了具有黄酮类母核小分子化合物库。并选择其中母核不同位置异戊烯基取代的化合物库内小分子,通过评价化合物促P19胚胎癌(embryonal carcinoma, EC)细胞轴突生长(细胞骨架蛋白)和囊泡摄取功能活性筛选,初步发现小分子化合物4a具有促神经分化活性。基于初步筛选结果进一步在ES细胞中评价确认(次级筛选),才能确认活性化合物。因此本文在第一部分进一步采用小鼠ES细胞体外分化神经元模型,以神经骨架蛋白表达和囊泡摄取功能为指标,评价黄酮类化合物4a的促神经分化作用,并初步探索细胞分裂活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路在其中的作用。神经元是可兴奋细胞,具有高能量需求,用于维持基本生命活动。线粒体是细胞内产生ATP的主要细胞器,为生命活动提供能量来源。神经元本身储存ATP很有限。线粒体能量代谢发生障碍已成为缺血性脑损伤和神经退行性疾病公认的早期病理现象,长期脑能量供应不足,是神经元功能下降和死亡的重要原因。线粒体在神经发生、神经突起生长和维持神经可塑性中也有重要作用,因此本研究第二部分考察了ES细胞定向分化神经元过程线粒体发生分布、线粒体膜电位(Ψm)变化及能量代谢方式,探索化合物4a调控线粒体能量代谢与促ES细胞神经分化相关性。并在第三部分探索了化合物4a促小鼠ES细胞分化为神经元的内在分子机制,着重探索与能量发生系统密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)在其中所扮演的角色,并对上下游分子事件和信号通路,如p-连环蛋白(β-catenin)/T细胞因子(T cell factor, TCF)、Mfn2和线粒体Ca2+进行了深入探索。1.黄酮类化合物库内小分子4a促ES细胞神经分化研究利用小鼠ES细胞体外分化神经细胞实验体系,以神经特异性骨架蛋白和囊泡摄取功能为指标评价黄酮类化合物4a的促神经分化活性,并初步探索MAPK信号通路在其中的作用。结果发现10-7mol/L化合物4a共孵育,能促小鼠ES细胞体外分化为神经元样细胞,显著提高分化所得细胞中神经元比例,并上调神经特异性蛋白巢蛋白(Nestin),微管蛋白(β-tubulin Ⅲ),神经丝蛋白(Neurofilament, NEFM)和突触素(synaptophysin)的表达量。FM1-43FX荧光结果显示,化合物4a能提高ES衍生神经元的囊泡摄取功能。ERK1/2磷酸化参与化合物4a促神经分化过程,采用MEK抑制剂U0126(10-5M)预处理细胞后,可显著抑制化合物4a促神经分化作用。上述结果提示,化合物4a促小鼠ES细胞神经分化伴有提高神经特异性蛋白表达和突触囊泡摄取功能,MEK-ERK1/2通路参与此过程。2.化合物4a调控线粒体能量代谢与促ES细胞神经分化相关性本部分实验从线粒体发生分布、线粒体膜电位(Ψm)变化及能量代谢方式角度,探索了黄酮类化合物4a促小鼠ES细胞体外分化为神经元的内在作用机制。首先采用活细胞线粒体荧光染料MitoTracker Red与不同分化阶段细胞特异性蛋白双染,发现无论是ES细胞,还是化合物4a诱导的神经前体细胞和神经元均有线粒体分布,且在神经前体细胞中发现线粒体引领轴突生长现象,这与化合物4a能增加cAMP含量相关。其次用JC-1染色考察线粒体Ψm变化,结果发现化合物4a能促使神经分化中线粒体绿色荧光向红色荧光转变,提示神经分化过程中,Ψm逐渐趋于正常,神经元分化与线粒体Ψm维持呈良好的相关性。神经前体细胞中相关能量代谢指标的检测结果表明,化合物4a提高了细胞对葡萄糖的消耗速率,但无显著性差异；化合物4a能显著提高神经分化早期与线粒体呼吸相关的氧气消耗率OCR值,并降低与糖酵解相关的胞外酸化率ECAR值。同时,化合物4a也降低了乳酸产率和乳酸脱氢酶活力。化合物4a降低细胞ATP含量可能与产生的ATP被高能量需求的神经前体细胞消耗有关。线粒体Ca2+特异性染料Rhod-2检测结果表明4a能调节神经前体细胞线粒体Ca2+瞬变功能,从而维持细胞内Ca2+稳态和调节ATP产生。Rhod-2和Mito green的共染结果表明化合物4a能提高神经前体细胞线粒体Ca2+浓度。电镜结果也表明,化合物4a组神经前体细胞中确实存在内质网-线粒体相互作用。综上所述,化合物4a能通过促进线粒体成熟和维持Ψm正常水平,调整线粒体分布,促神经分化早期细胞能量代谢方式转变以满足细胞神经分化的能量需求,从而发挥促小鼠ES细胞神经分化作用。3.化合物4a经由PPAR-β-Mfn2-[Ca2+]M调控线粒体能量代谢促ES细胞神经分化本部分探索了化合物4a促小鼠ES细胞分化为神经元时的内在分子机制,着重探索PPARs在其中所扮演的角色,并对上下游分子事件和信号通路,如β-catenin/TCF、Mfn2和线粒体Ca2+进行了深入探索。PPARs家族蛋白与线粒体能量发生系统密切相关。本研究结果相继论证：(1)免疫荧光双染结果显示,PPAR-β与神经前体细胞标志物Nestin和神经元标记物β-tubulin Ⅲ共叠加。(2)PPAR-β蛋白表达水平随着化合物4a促神经分化显著上调,并激活靶基因ACS2。(3)加入PPAR-β拮抗剂GSK0660严重影响化合物4a诱导的神经分化,但对RA的促神经分化作用不影响。(4)干扰PPAR-β可抑制化合物4a促神经分化作用。上述结果综合表明,PPAR-β确实参与化合物4a促小鼠ES细胞神经分化过程,并且在神经分化早期就起作用,该作用机制与RA截然不同。PPAR-β可能作为分子开关,调控神经前体细胞中线粒体功能改变,从而发挥化合物4a促神经分化作用。化合物4a能在神经分化早期显著上调PGC-1α、 Nrfl和TFAM mRNA水平,促进线粒体生物合成；干扰PPAR-β蛋白表达能下调化合物4a引起的上述转录因子mRNA水平,表明PPAR-β在化合物4a促神经前体细胞线粒体生物合成中发挥重要作用。化合物4a能在神经分化早期显著上调PGC-1α蛋白,该结果与RT-PCR结果相符；同时,化合物4a能选择性上调分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn2的表达,提示化合物4a能在神经分化早期调控线粒体分裂融合；干扰PPAR-β蛋白表达能下调化合物4a引起的PGC-1α、Drp1和Mfn2蛋白表达,表明PPAR-β在化合物4a促神经前体细胞线粒体生物合成和分裂融合中发挥重要作用,从而满足细胞神经分化的能量需求,免疫荧光双染的结果也与之相符。干扰PPAR-β蛋白表达降低了神经分化早期细胞对葡萄糖的消耗速率,但无显著差异；与线粒体呼吸相关的氧气消耗率OCR值随着PPAR-β蛋白沉默显著下调,而与糖酵解相关的胞外酸化率ECAR值则上调,以上结果表明干扰PPAR-β蛋白表达虽然对细胞的葡萄糖消耗速率影响不大,但能抑制化合物4a引起糖酵解向线粒体呼吸的转变作用,从而降低了葡萄糖的利用效率,影响神经分化进程。线粒体Ca2+特异性染料Rhod-2检测结果表明,干扰PPAR-β蛋白表达能拮抗化合物4a调控的线粒体Ca2+瞬变功能。同时,Rhod-2和Mito green的共染结果也显示,干扰PPAR-β蛋白表达能降低神经分化早期细胞线粒体中的Ca2+浓度,提示了干扰PPAR-β蛋白表达能影响细胞内Ca2+的稳态维持和线粒体能量代谢。实验结果表明化合物4a能促进活性形式GSK3β向非活性形式p-GSK3p的转变,从而减少了β-catenin由于被GSK3β磷酸化而发生的降解,使β-catenin的含量升高。β-catenin入核后与TCF结合,启动下游PPAR-β等目的基因表达,从而进一步促进Nestin表达上升。选取β-catenin/TCF的抑制剂FH535最佳浓度15μmol/L进行研究,结果表明FH535对β-catenin的表达量不影响,但通过抑制β-catenin/TCF转录活性,下调了PPAR-β和Nestin的表达,化合物4a可以部分逆转FH535的拮抗作用。以上结果表明β-catenin/TCF信号通路确实参与化合物4a促PPAR-β蛋白表达上调。受体配体竞争性结合实验结果显示,PPAR-β受体激动剂L165041与PPAR-β结合的IC5o是39.90nmol/L,而化合物4a是11.2μmol/L,提示化合物4a具有竞争性结合PPAR-β的作用,但效价显著低于L165041。分子对接实验进一步模拟了化合物4a与PPAR-β的具体结合情况,打分结果也辅助表明化合物4a与PPAR-β具有一定亲和力,但本实验中化合物4a促神经分化所选浓度为10-7mol/L,在该浓度下化合物4a与PPAR-β竞争结合能力有限,提示化合物4a直接激活PPAR-β并不是发挥促神经分化作用的主要原因。RXR在神经分化早期各组细胞中均表达,提示具备与PPAR-β结合形成异源二聚体的物质基础,但是不论加入化合物4a处理或是干扰PPAR-β蛋白表达都不影响RXR的表达水平,提示RXR的蛋白表达水平与化合物4a促PPAR-β转录活性关系不大。结论：1.黄酮类化合物4a能提高神经特异性蛋白表达和突触囊泡摄取功能,具有促小鼠ES细胞定向分化为神经元活性,MEK-ERK1/2通路参与此过程。2.化合物4a能通过促线粒体成熟和维持膜电位正常水平,调整线粒体分布,促神经分化早期细胞糖酵解向氧化磷酸化转变,来满足细胞轴突生长和神经分化能量需求。发现了化合物4a能诱导神经前体细胞中线粒体引领轴突生长现象。3.化合物4a主要通过β-catenin/TCF信号通路上调PPAR-β蛋白表达来提高其转录活性,并经由PPAR-β-Mfn2-[Ca2+]M调控线粒体能量代谢,促使神经分化早期细胞能量代谢方式转变来满足细胞神经分化的能量需求,从而发挥促小鼠ES细胞神经分化的作用,此作用机制不同于维甲酸。