基因重配造成了人类历史上多次流感的大流行,1957年的亚洲流感就是由于当时流行的H1N1亚型毒株从禽流感病毒中获得了HA、NA和PB1基因；1968年的香港流感(H3N2)则是当时H2N2亚型人流感病毒从禽流感病毒中获得HA和PB1基因。2009年甲型H1N1流感病毒则被认为是四源基因重排的结果,PB2和PA来源于禽流感病毒,PB1来源于1968香港H3N2人流感病毒,HA、NP和NS来源于早期流行于北美地区的H1N1猪流感病毒,而NA和M则由20世纪90年代初欧亚猪群中流行的H1N1病毒提供。2013年初在中国华东地区发生了H7N9亚型禽流感病毒感染人事件,到目前为止该病毒仍在不断的感染人,并且引起了比较高的死亡率。该病毒是通过H7亚型的病毒与带N9 NA基因的病毒,以及流行于我国家禽中的H9N2亚型禽流感病毒的基因重配产生的。高致病性禽流感(HPAI)H5N1最早于1996年从我国广东地区的发病鹅群中分离到,其HA基因已经进化出Clade0-9共计10个不同的进化分支,其中的一些分支随着病毒的不断进化还出现了二级、三级甚至是四级亚分支。H5N1亚型HPAI由于能感染少部分人并具有高致死率,给人类公共卫生安全构成巨大的威胁。尽管目前H5N1高致病性禽流感病毒还没有获得在人与人之间高效传播的能力,但是近年来开始不断的从各种家禽里分离到许多新型重组病毒,这些病毒的HA基因都来源于Gs/GD/96-like,而其它基因却来自其它各种亚型的流感病毒。了解这些新型重组H5亚型高致病性禽流感病毒的致病性和传播性,对于防控流感大流行具有重要的意义。本实验室2010年在华东地区的活禽交易市场中分离到一株新型重组H5N2禽流感病毒A/chicken/Hebei/1102/2010 (HB10)。研究发现它的HA来源于我国流行的Clade 7.2 H5亚型禽流感病毒而其它基因来源于H9N2禽流感病毒,且HB10的内部基因片段与H7N9流感病毒高度相似。我们推测它可能通过进一步的基因变异获得类似于H7N9病毒直接感染人的能力。为了研究HB10跨种间传播的潜在机制,我们将该病毒在小鼠肺内连续传代,并对传代过程中病毒的毒力变化进行测定。结果显示,当将HB10病毒传到第5代时其对小鼠的半数致死剂量(MLD50)由>1070EID50下降为10485EID50,其毒力增强了100多倍；而传到第15代时,病毒变异为高毒力毒株。随后,我们对第15代病毒进行了克隆、纯化,获得一株对小鼠高毒力的鼠适应毒HB10-MA,并对病毒HB10-MA的生物学特性进行了研究。结果显示,HB10-MA的MLD50为1025EID50,与HB1O相比其毒力至少高出1045倍；同时HB10-MA病毒在小鼠肺内的增殖滴度和速度均显著高于HB10病毒,并且HB10-MA病毒的复制部位从肺脏扩展到了心、肝、脾、肾及脑组织,而HB10病毒仅能在肺脏中复制。与此同时,HB10-MA在哺乳细胞MDCK和A549上的复制能力也明显增强。序列比对发现,与HB10病毒相比HB10-MA在4个基因上发生了5个氨基酸位点的突变,分别为HA-S227N,PB2-Q591K, PB2-D701N, PA-V554I和NP-R351K.我们推测这些氨基酸位点的突变可能与新型重组H5N2禽流感病毒在小鼠肺内传代过程中的毒力增强有关。为了进一步研究鼠适应毒HB10-MA对小鼠致病性增强的分子机制,我们利用反向遗传技术分别以HB10和HB10-MA为骨架拯救了一系列的单基因互换重组病毒,并比较了它们在小鼠模型上的毒力差异。我们发现PB2、PA基因是鼠适应毒HB10-MA的毒力增强的重要基因,但是PB2基因起主导作用。由于HB10与HB10-MA在PB2基因上仅有2个氨基酸位点的差异,因此我们拯救了PB2基因单个位点突变的病毒,并评价了它们在小鼠中的毒力从而进一步确定影响HB10-MA和HB10对小鼠毒力差异的关键氨基酸位点。结果发现PB2的591K和701N两个位点是导致鼠适应毒高毒力的关键氨基酸位点,而且它们起着协同作用。PB2上591和701两个位点的同时突变能在很大程度上引起HB10和HB10-MA病毒毒力、复制能力以及聚合酶活性协同改变。因此,我们的结果表明PB2上591K和701N两个位点的共同变异是使新型重组H5N2亚型禽流感病毒鼠适应毒毒力增强的关键。PB2的627K被认为是许多禽源和人源流感病毒对哺乳动物高致病性的关键氨基酸。因此,我们将PB2-E627K与Q591K和D701N以单点、双点或三点突变的形式引入HB10骨架,研究这些位点对病毒毒力的影响。首先,我们发现这些位点的单点突变增强了HB10对小鼠的毒力。其次,我们发现与单点突变相比,PB2-D701N与PB2-Q591K或PB2-E627K双突变明显增强病毒对小鼠的毒力。然而,PB2-Q591K与PB2-E627K双突变虽然增强了病毒的体外聚合酶活性,但它们显著致弱了病毒对小鼠的毒力。因此,我们的研究再次强调PB2基因在禽流感病毒适应哺乳动物中的关键作用,将有助于我们深入了解新型重组H5N2流感病毒跨种间传播和致病的分子机制。近年来又不断的从各种家禽里分离到了与不同的NA亚型(包括N2、N5、N6、N8)重组的新型H5高致病性禽流感病毒,并且这些病毒的HA基因均属于Clade2.3.4变异亚分支。在这些新型重组病毒中,部分基因型已经呈现流行的趋势。最近,在一些东南亚国家相继发生了几次新型重组H5N6禽流感疫情且在我国发生了H5N6感染人事件,与此同时H5N8也已经相继在至少11个国家中爆发疫情。由于流感病毒获得结合a-2,6唾液酸受体的能力是其在人间大流行的先决条件。因此,我们首先对这些新型重组的H5亚型高致病性禽流感病毒进行了受体结合能力的测定。结果发现所有检测的新型重组H5亚型病毒在结合α-2,3唾液酸受体的同时,也获得了α-2,6唾液酸受体的结合能力。然而受体结合特性虽然被认为是流感病毒宿主范围的主要因素,但是获得了α-2,6唾液酸受体的结合能力的病毒并不一定能在人群间有效地传播。因此,接下来,我们用豚鼠模型来评价了新型重组H5亚型病毒的复制能力以及潜在的传播能力。我们发现所有检测的新型重组H5亚型病毒均能在攻毒组豚鼠体内有效地复制,值得注意的是其中的一株H5N2(GS/EC/1112/11)和一株H5N5(031)病毒在豚鼠间具有有效地接触传播能力。我们的研究表明当前流行于各个国家的此类新型重组H5亚型病毒可能会对人类的健康存在一定的威胁。因此,加强该病毒在家禽中的流行病学监测、病毒分离与生物学特性分析有重要意义。为了进一步确定影响新型重组H5亚型病毒受体结合性的关键氨基酸位点,本研究,以只有α-2,3唾液酸受体的结合能力的Clade 2.3.4病毒A/mallard/Huadong/S/2005 (HD/05)为骨架,利用反向遗传技术,对差异氨基酸位点(共有8个氨基酸的差异)进行定点突变,并评价点突变病毒的受体结合性。研究结果发现影响新型重组H5亚型病毒受体结合性的关键氨基酸位点是HA的160位氨基酸,T160A的突变能导致HA的158糖基化位点缺失并使得病毒获得α-2,6唾液酸受体的结合能力。接着我们对突变株HD-160A在豚鼠体内的复制能力以及豚鼠间直接接触传播的能力进行评价,结果发现HA上158糖基化位点的缺失的病毒不但能在豚鼠体内有效的复制,还能在豚鼠间进行有效地直接接触传播。已有研究表明HA的158位糖基化位点的缺失能导致病毒对小鼠的毒力增强。我们也发现HA上158糖基化位点的缺失可以导致病毒对小鼠的毒力增强,同时增强了病毒在哺乳细胞MDCK和A549上的复制能力。因此,我们的研究表明HA的158糖基化位点的缺失可以作为一个分子标记用来评价Clade 2.3.4变异亚分支H5病毒引起大流行的潜在能力。此外,HA的158位糖基化位点的缺失导致Clade 2.3.4变异亚分支H5病毒同时具备α-2,3和α-2,6受体结合性,可能对人类和家禽都能造成危害。因此,需加强此类病毒的监测。综上所述,我们利用高毒力的鼠适应毒,发现PB2基因的变异是新型重组H5N2流感病毒跨种间传播和毒力增强的关键因素,且进一步确定了PB2的591K和701N两个位点的共同变异是新型重组H5N2亚型禽流感病毒鼠适应毒毒力增强的关键。同时,发现影响新型重组H5亚型病毒受体结合性的关键氨基酸位点是病毒HA的158糖基化位点的缺失。我们认为HA的158糖基化位点的缺失与否可以作为一个分子标记用来评价Clade 2.3.4变异亚分支H5病毒引起大流行的潜在能力。因此,我们的研究进一步说明对H5亚型禽流感病毒加强流行病学监测具有重要意义,是为防控流感大流行作准备的重要措施。