论文部分内容阅读
性发育(puberty)是哺乳动物个体性成熟并获得生殖能力的过程,受到遗传、环境等多种因素的影响。下丘脑-垂体-性腺轴系统控制着人类生殖系统的发育、成熟及功能的维持,对哺乳动物性发育起着决定性的作用,其所分泌的各种激素水平直接影响或控制青春期发育。在正常情况下,人类生长发育到一定时期时,随着下丘脑—垂体—性腺轴(HPGA)的成熟,启动青春期的发育,但其确切的分子机制尚不明确。近年来,很多人利用小鼠对性发育机制进行研究。本实验室从2004年开始,从400多种近交品系小鼠品系中,筛选出两个性发育启动时间有明显差异,全基因组及线粒体背景已知的近交品系小鼠C3H/HeJ和C57BL/6J作为亲本杂交产生F2代,全基因组STR扫描和遗传分析结果显示,在6号、13号和X染色体得到了与雌鼠阴门开启时间相关的区段,其中X染色体上的-25cM (DXMit103-DXMit119, LOD=3.86)的QTL区段是显著相关且首次发现的,遗传效应为C57BL/6J显性、C3H/HeJ隐性。针对小鼠X染色体初步定位的QTL区段构建数个特异性区段同类系,利用STR和SNP位标进行基因分型,并结合表型鉴定,在N7代家系中将小鼠性发育QTL区段缩短到X染色体rs13483770-rs29055848之间lcM的范围内,最终将候选基因定位在了miR-505。miR-505是非编码的内源性小分子RNA,初级体只有90bp,成熟体有两种状态,分别为miR-505-3P和miR-505-5P。其能在转录后水平负性调节靶mRNA表达。在正常状态下,miR-505-5P在RNA水平的表达量高于miR-505-3P。本课题组为深入研究miR-505对性发育的影响,构建了全cDNA的转基因小鼠。本研究基于stem-loop逆转录引物建立实时定量PCR技术检测成熟的miRNA;和基于绝对定量法的qRT-PCR检测microRNA的前体和初级体。Stem-loop qRT-PCR通过改进的茎环引物逆转录方案,采用相对定量的方法对样本进行分析。用以检测前体和初级的qRT-PCR方案,采用绝对定量的分析方法,分别检测出前体和初级体的初始拷贝数。利用该技术检测miR-505在转基因小鼠及其对照品系C57BL/6J中在5、15、25、35四个不同日龄下,丘脑、垂体、卵巢、肌肉、脂肪五个不同组织中miR-505表达水平的差异,结果显示：在不同日龄不同组织中,pri-miR-505的表达量都非常地低,只有几十拷贝；但是在5和15日龄下,pre-miR-505初始拷贝数在转基因小鼠不同组织中均比C57BL/6J高约10多倍。在成熟状态下,miR-505-5P除丘脑组织外,在垂体、卵巢、肌肉和脂肪组织中,其相对表达量基本上都大于1,尤其在卵巢和脂肪组织中,在5和15天日龄下,其相对表达量更是高达4左右。miR-505-3P其在位于性发育轴上的丘脑、垂体、卵巢组织中,相对表达量基本上都在1左右。同时,本研究鉴定了miR-505转基因小鼠及近交系品系C57BL/6J的表型,包括：阴门开启、角质化和生长曲线,发现均无显著性差异。综上所述,本研究成功的构建了检测microRNA前体和成熟体的经济实用、灵敏、高效的检测方案；利用该技术对不同日龄、不同组织的转基因小鼠和野生型小鼠进行分析,发现在转基因小鼠中miR-505的前体是明显提高的,但是成熟体在性发育相关丘脑-垂体-性腺轴上并没有表现出来,表明转基因小鼠的构建是成功的,但在基因表达水平上并没有显现出来；同时,由miR-505-3P和miR-505-5P在转基因小鼠中表达量的差异推测,miR-505-5P与性发育无关,这需要进一步的实验证明。通过本研究,对性发育的后续工作奠定了实验和理论基础。