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目的:
在实体瘤内由于耗氧大而血供不足，会使肿瘤细胞长期处于低氧环境，而许多研究表明这种处于低氧环境的肿瘤细胞可能更具有恶性。如果弄清楚肿瘤细胞在低氧环境下会发生哪些特征性改变就可为研究肿瘤的发生、发展甚至治疗提供重要的参考价值。目前已知能量代谢异常是肿瘤细胞的特征之一。乳腺癌作为在女性中发病率最高的恶性肿瘤，同样存在能量代谢异常问题。只是由于能量代谢包括的范围广，研究难度大，肿瘤细胞的很多代谢异常问题目前并未完全清楚。本研究拟以乳腺癌中预后不佳的三阴性乳腺癌作为研究对象，希望探究在低氧环境下该类型癌细胞在糖代谢方面发生的改变及其分子机制。如果给予低氧环境，包括肿瘤细胞在内的大部分动物细胞都会通过稳定表达低氧诱导因子-1(HIF-1)这一重要转录因子来调节细胞内多种基因的表达以适应低氧环境，其中包括参与糖代谢的基因。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两种亚基组成的二聚体蛋白。HIF-1β亚基一般在细胞内组成性表达，且不受氧浓度的影响，但是HIF-1α亚基在常氧条件下会降解，只有在低氧环境下保持稳定。因此，HIF-1也只有在低氧环境下才能够保持稳定并发挥转录因子的作用。由LDHA基因所编码蛋白质组成的乳酸脱氢酶(LDH)是催化糖的无氧氧化代谢途径中最后一步反应的酶。鉴于代谢的复杂性和LDHA的重要性，本研究首先希望明确LDHA在三阴性乳腺癌细胞中是否具有促肿瘤作用，然后筛选合适的低氧研究细胞模型，最后再探究在低氧环境下HIF-1能否通过LDHA调节三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用。
方法:
本研究主要利用基因重组技术构建了LDHA基因真核表达质粒和siRNA-LDHA表达载体，并导入细胞进行过表达或沉默LDHA基因的表达;利用siRNA-HIF-1α表达载体沉默细胞HIF-1α基因的表达;琼脂糖凝胶电泳检测LDH同工酶谱;MTT或CCK-8法、平板克隆形成、细胞划痕、明胶酶谱和Transwell等实验技术分别检测乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;Western blot技术检测蛋白质表达;流式细胞术检测细胞凋亡;采用检测试剂盒通过比色法分别测定乳腺癌细胞对葡萄糖的摄入水平、乳酸的生成量和LDH总活性。
结果:
1.LDHA具有促肿瘤作用
通过蛋白表达检测和同工酶谱分析发现多数乳腺癌细胞系中LDHA蛋白高表达，但在BT549细胞系中LDHA蛋白表达较低;通过在BT549细胞中过表达或沉默LDHA基因的表达，证实LDHA具有促细胞增殖、迁移和侵袭的能力，并且分析同工酶谱后还发现LDHA基因的表达变化最主要影响LDH5同工酶的活性。
2.建立了物理低氧和化学低氧两种细胞模型
通过不断优化实验条件，综合不同时间与浓度组合下的HIF-1α蛋白表达结果，最终确定以2％氧浓度处理24h为条件建立物理低氧细胞模型，以100μmol/L CoCl2处理24h为条件建立化学低氧细胞模型;比较两种低氧细胞模型后发现在物理低氧模型条件下细胞凋亡会明显增加，而在化学低氧模型下的细胞凋亡则没有明显改变;两种低氧细胞模型的MMP-2蛋白表达均明显升高，特别是在物理低氧细胞模型中升高十分明显;但是由于物理低氧细胞模型会发生凋亡，未能直接检测细胞的侵袭和迁移能力，而在化学低氧细胞模型中可观察到细胞的侵袭及迁移能力明显增强。
3.低氧环境可增加三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用
低氧处理BT549和MDA-MB-231两种三阴性乳腺癌细胞后，不仅观察到HIF-1α蛋白升高十分明显，还可见与糖的无氧氧化代谢相关的Glut-1、HKⅡ、PDH-E1α、LDHA蛋白表达均明显升高，并呈一定程度的时间和浓度依赖性（PDH-E1α蛋白除外）;同工酶谱结果显示两种低氧细胞模型的LDH5同工酶活性也明显升高;还检测到两种低氧细胞模型均会增加细胞对葡萄糖的摄入、LDH总活性和乳酸的生成量。
4.低氧环境下HIF-1可通过增加LDHA的表达而促进三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用
在低氧环境下分别沉默HIF-1α和LDHA基因表达后，均可观察到LDHA蛋白表达、LDH5同工酶活性、细胞对葡萄糖摄入、LDH总活性和乳酸的生成均明显降低，并且沉默HIF-1α基因对葡萄糖摄入和乳酸生成的降低效果比沉默LDHA基因更明显，但是沉默LDHA基因表达对LDH总活性的降低作用比沉默HIF-1α更明显。
结论:
1.LDHA在三阴性乳腺癌细胞中具有促肿瘤作用，这种促肿瘤作用可能与LDHA基因高表达导致LDH5同工酶活性增加相关。
2.综合分析两种低氧细胞模型，由于物理低氧环境是真实的低氧环境，应该更适合作为低氧研究的细胞模型。
3.低氧环境不仅使HIF-1α蛋白保持稳定高表达，还可使三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化代谢途径相关的多种蛋白质表达以及LDH5同工酶活性明显增加，最终使糖的无氧氧化作用增强;这种促进三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用至少部分原因是由于在低氧环境下HIF-1α蛋白不被降解而使转录因子HIF-1保持稳定表达，从而增强了LDHA基因的表达和LDH5同工酶活性所致。
在实体瘤内由于耗氧大而血供不足，会使肿瘤细胞长期处于低氧环境，而许多研究表明这种处于低氧环境的肿瘤细胞可能更具有恶性。如果弄清楚肿瘤细胞在低氧环境下会发生哪些特征性改变就可为研究肿瘤的发生、发展甚至治疗提供重要的参考价值。目前已知能量代谢异常是肿瘤细胞的特征之一。乳腺癌作为在女性中发病率最高的恶性肿瘤，同样存在能量代谢异常问题。只是由于能量代谢包括的范围广，研究难度大，肿瘤细胞的很多代谢异常问题目前并未完全清楚。本研究拟以乳腺癌中预后不佳的三阴性乳腺癌作为研究对象，希望探究在低氧环境下该类型癌细胞在糖代谢方面发生的改变及其分子机制。如果给予低氧环境，包括肿瘤细胞在内的大部分动物细胞都会通过稳定表达低氧诱导因子-1(HIF-1)这一重要转录因子来调节细胞内多种基因的表达以适应低氧环境，其中包括参与糖代谢的基因。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两种亚基组成的二聚体蛋白。HIF-1β亚基一般在细胞内组成性表达，且不受氧浓度的影响，但是HIF-1α亚基在常氧条件下会降解，只有在低氧环境下保持稳定。因此，HIF-1也只有在低氧环境下才能够保持稳定并发挥转录因子的作用。由LDHA基因所编码蛋白质组成的乳酸脱氢酶(LDH)是催化糖的无氧氧化代谢途径中最后一步反应的酶。鉴于代谢的复杂性和LDHA的重要性，本研究首先希望明确LDHA在三阴性乳腺癌细胞中是否具有促肿瘤作用，然后筛选合适的低氧研究细胞模型，最后再探究在低氧环境下HIF-1能否通过LDHA调节三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用。
方法:
本研究主要利用基因重组技术构建了LDHA基因真核表达质粒和siRNA-LDHA表达载体，并导入细胞进行过表达或沉默LDHA基因的表达;利用siRNA-HIF-1α表达载体沉默细胞HIF-1α基因的表达;琼脂糖凝胶电泳检测LDH同工酶谱;MTT或CCK-8法、平板克隆形成、细胞划痕、明胶酶谱和Transwell等实验技术分别检测乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;Western blot技术检测蛋白质表达;流式细胞术检测细胞凋亡;采用检测试剂盒通过比色法分别测定乳腺癌细胞对葡萄糖的摄入水平、乳酸的生成量和LDH总活性。
结果:
1.LDHA具有促肿瘤作用
通过蛋白表达检测和同工酶谱分析发现多数乳腺癌细胞系中LDHA蛋白高表达，但在BT549细胞系中LDHA蛋白表达较低;通过在BT549细胞中过表达或沉默LDHA基因的表达，证实LDHA具有促细胞增殖、迁移和侵袭的能力，并且分析同工酶谱后还发现LDHA基因的表达变化最主要影响LDH5同工酶的活性。
2.建立了物理低氧和化学低氧两种细胞模型
通过不断优化实验条件，综合不同时间与浓度组合下的HIF-1α蛋白表达结果，最终确定以2％氧浓度处理24h为条件建立物理低氧细胞模型，以100μmol/L CoCl2处理24h为条件建立化学低氧细胞模型;比较两种低氧细胞模型后发现在物理低氧模型条件下细胞凋亡会明显增加，而在化学低氧模型下的细胞凋亡则没有明显改变;两种低氧细胞模型的MMP-2蛋白表达均明显升高，特别是在物理低氧细胞模型中升高十分明显;但是由于物理低氧细胞模型会发生凋亡，未能直接检测细胞的侵袭和迁移能力，而在化学低氧细胞模型中可观察到细胞的侵袭及迁移能力明显增强。
3.低氧环境可增加三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用
低氧处理BT549和MDA-MB-231两种三阴性乳腺癌细胞后，不仅观察到HIF-1α蛋白升高十分明显，还可见与糖的无氧氧化代谢相关的Glut-1、HKⅡ、PDH-E1α、LDHA蛋白表达均明显升高，并呈一定程度的时间和浓度依赖性（PDH-E1α蛋白除外）;同工酶谱结果显示两种低氧细胞模型的LDH5同工酶活性也明显升高;还检测到两种低氧细胞模型均会增加细胞对葡萄糖的摄入、LDH总活性和乳酸的生成量。
4.低氧环境下HIF-1可通过增加LDHA的表达而促进三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用
在低氧环境下分别沉默HIF-1α和LDHA基因表达后，均可观察到LDHA蛋白表达、LDH5同工酶活性、细胞对葡萄糖摄入、LDH总活性和乳酸的生成均明显降低，并且沉默HIF-1α基因对葡萄糖摄入和乳酸生成的降低效果比沉默LDHA基因更明显，但是沉默LDHA基因表达对LDH总活性的降低作用比沉默HIF-1α更明显。
结论:
1.LDHA在三阴性乳腺癌细胞中具有促肿瘤作用，这种促肿瘤作用可能与LDHA基因高表达导致LDH5同工酶活性增加相关。
2.综合分析两种低氧细胞模型，由于物理低氧环境是真实的低氧环境，应该更适合作为低氧研究的细胞模型。
3.低氧环境不仅使HIF-1α蛋白保持稳定高表达，还可使三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化代谢途径相关的多种蛋白质表达以及LDH5同工酶活性明显增加，最终使糖的无氧氧化作用增强;这种促进三阴性乳腺癌细胞内糖的无氧氧化作用至少部分原因是由于在低氧环境下HIF-1α蛋白不被降解而使转录因子HIF-1保持稳定表达，从而增强了LDHA基因的表达和LDH5同工酶活性所致。