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钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是重要的蛋白激酶之一,广泛存在于各种植物当中,参与各种生物与非生物胁迫应答反应、生长发育、物质代谢、植物激素信号转导。巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)作为一种重要的热带经济作物和能源植物,是目前天然橡胶的主要来源。克隆橡胶树钙依赖蛋白激酶基因并对其分子特征以及功能进行分析,研究其在橡胶树中潜在的生物学功能,对于深入了解橡胶树产胶的分子机制,具有重要的理论意义和实践价值。本研究通过克隆橡胶树钙依赖蛋白激酶基因,并对其基因和蛋白结构、表达特征等进行了分析,为进一步研究其生物学功能奠定基础。主要获得研究成果如下：1、根据筛选乙烯利刺激条件下巴西橡胶树胶乳和未处理胶乳差异表达的cDNA消减文库,获得了一个与钙依赖蛋白激酶具有较高同源性的EST序列HbEST47,利用RACE技术,从巴西橡胶树中首次克隆到了一个编码钙依赖蛋白激酶的基因,将其命名为HbCDPK1(GeneBank登录号：EU581818)。序列分析显示,该基因全长cDNA含有2400个核苷酸,其中包含一个1671bp的完整开放阅读框(ORF)结构,编码一个含有556个氨基酸残基的多肽。与蓖麻(Ricinus communis, XP002518484)、毛果杨(Populus trichocarpa, XP002316527)、人参(Panax ginseng, ACY78680)、番茄(Solanum lycoper, CAC87494)的CDPK同源性分别高达85.10%、80.54%、75.58%、和72.09%。2、生物信息学分析表明,HbCDPK1定位于内质网上,含有一个蛋白激酶结构域和4个Ca2+结合结构域,N-末端没有信号肽,属于不稳定的亲水蛋白。预测其具有转录、转录调控、信号转导和激素、逆境应答的功能。3、利用染色体步移(Genome Walking)技术,从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆到了HbCDPK1基因2130bp的5’端调控序列(GeneBank登录号：JF806669)。对其序列进行分析显示,该片段除了含有典型的核心启动子区域外,还含有多个启动子元件以及多种与胁迫诱导和激素相关的顺式调控元件,以上结果暗示钙依赖蛋白激酶HbCDPK1可能参与了橡胶树的信号转导过程以及对于激素、逆境胁迫响应的调控作用。4、利用半定量RT-PCR技术研究了HbCDPK1的表达特征。实验结果显示,HbCDPK1在巴西橡胶树中呈现出组成型表达,同时也具有明显的组织特异性,其在胶乳中的表达明显高于其他组织,叶片中的表达量次之,树根和树皮中少量表达。乙烯利(ET)、茉莉酸(JA)、和机械伤害都能够诱导HbCDPK1在胶乳中的表达。5、构建了2个原核表达载体pET-EHbCDPKl(全长序列)、pET_ECDPK 1(缺失序列),经原核表达、蛋白纯化、酶活测定、凝胶迁移率分析,结果显示HbCDPKl具有激酶活性,并且C-末端具有结合Ca2+的能力。构建了HbCDPKl过量表达的植物表达载体pCAMBIA1304-EUCDPK1,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法获得了5株转基因烟草。经过PCR和GFP报告基因检测,初步判定HbCDPK1已经转入烟草基因组中。结论：HbCDPK1是一种Ca2+依赖的蛋白激酶,在巴西橡胶树中呈组成型表达以及明显的组织差异性,表达量依次为胶乳、树叶、树皮、树根；JA、ET、机械伤害能够诱导HbCDPK1在胶乳中的表达。HbCDPK1是巴西橡胶树中一种多功能调节酶,其在转录、转录调控、信号转导、物质代谢、激素和环境应激反应等过程中都发挥着作用,需要进一步研究其功能。