本研究以广东省鸭粪中分离的三种疑似原虫为研究对象，依次对其进行了病原形态学与分子生物学鉴定，并建立了相应的多重PCR检测方法。　　 疑似卵囊先后经过饱和蔗糖漂浮、改良抗酸染色及孢子化试验，然后对其进行显微镜检查，根据观察到的形态特征进行初步鉴定，共发现三种原虫，即鸭源环孢子虫（Cyclospora sp.）、菲莱氏温扬球虫（Wenyonella philiplevinei）、贝氏隐孢子虫（Cryptosporidium baileyi），其中鸭源环孢子虫为国内首次报道。　　 采用饱和蔗糖漂浮法对鸭粪中三种原虫进行分离，用蔗糖密度梯度离心法对其进行纯化，用OMEGA公司的粪样DNA提取试剂盒提取卵囊的基因组DNA，根据GenBank中注册的相关基因序列，设计并合成5对引物（有两对是巢式引物），采用PCR技术扩增相应的目的片段，分别为：环孢子虫18S rRNA基因部分序列和ITS-1+序列、菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因部分序列、贝氏隐孢子虫ITS-1+序列，将扩增出的目的片段分别克隆至pMD-18T载体进行序列测定，并对测序结果进行序列分析。结果表明：环孢子虫的18S rRNA基因部分序列长度为294bp;环孢子虫的ITS-1+序列全长为668bp，其中18S rRNA基因部分序列长度为135bp，ITS-1基因全长为374bp，5.8SrRNA基因部分片段长度为159bp；菲莱氏温扬球虫的18S rRNA基因部分序列长度为422bp:贝氏隐孢子虫的ITS-1+序列长度为733bp，其中18S rRNA基因部分序列长度为354bp，ITS-1基因全长为331bp，5.8S rRNA基因部分片段长度为48bp。同源性比较及系统进化分析表明：鸭源环孢子虫18S rRNA基因与其它环孢子虫的相关序列同源性最高，达98％，进化树上位于同一分支；鸭源环孢子虫ITS-1基因高度特异，在GenBank中未发现同源性序列；菲莱氏温扬球虫的18S rRNA基因核苷酸序列与艾美耳科其它球虫的同源性较高，在90％左右，进化树分析表明其与艾美耳科其它球虫不在同一分支上；鸭贝氏隐孢子虫ITS-1+序列与GenBank中贝氏隐孢子虫的相关序列同源性最高，达99％，其中18S rRNA基因部分序列进化树分析表明其与贝氏隐孢子虫在同一分支上。　　 根据已测得的三种原虫的3个基因片段，按照多重PCR反应引物设计原则，分别设计出3对特异性引物，用来扩增环孢子虫ITS-1部分基因片段，菲莱氏温扬球虫18S rRNA基因部分序列片段，贝氏隐孢子虫ITS-l+片段，其大小分别为288bp（Cyclospora sp.）、402bp（W.philiplevinei）和694bp(C.baileyi)。在建立单项PCR检测方法的基础上，组合成多重PCR反应，并对多重PCR反应的引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、共同的退火温度进行了优化，建立了多重PCR反应体系，最后对该方法进行了敏感性、特异性及重复性试验。结果显示：在优化条件下该多重PCR方法对三种原虫的DNA检测量分别为：鸭源环孢子虫和贝氏隐孢子虫可达5.6Pg，菲莱氏温扬球虫可达100fg：对三种原虫均能扩增出相应目的条带，而对柔嫩艾美耳球虫、微小隐孢子虫等均不能扩增出目的条带；重复14次检测阳性模板，均能扩增出特异性目的条带。说明该多重PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好。采用该检测方法对100份临床样品进行检测，结果发现该方法较普通镜检方法敏感、特异，为临床上鸭源环孢子虫、菲莱氏温扬球虫和贝氏隐孢子虫的检测提供了技术支持，具有较好的应用前景。