小菜蛾(Plutella xylostella L.)属于世界性重大迁飞害虫,主要为害十字花科植物,而化学农药的滥用,致使小菜蛾对化学农药产生了严重的抗药性,每年都会对蔬菜等造成巨大的经济损失,因此探讨新型的微生物杀虫剂防治小菜蛾已经迫在眉睫。本研究以小菜蛾为研究材料,测定了虫生真菌-玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)侵染小菜蛾后不同时间的转录组,并利用RNAi技术研究了小菜蛾Toll家族在小菜蛾免疫防御虫生真菌侵染中的功能。本研究从分子水平上阐明小菜蛾免疫防御虫生真菌侵染的动力学机制,为以利用小菜蛾免疫系统为靶标的真菌杀虫剂的开发提供了新的思路。为探讨玫烟色棒束孢I.fumosorosea对小菜蛾侵染的动力学机制,本研究以3龄幼虫小菜蛾为研究材料,浓度为10~7孢子/ml的玫烟色棒束孢I.fumosorosea侵染3龄小菜蛾后,分别在其侵染后12 h、18 h、24 h和36 h取样,利用RNA-seq技术,测其转录组。对所得数据进行系统的分析。结果表明,在玫烟色棒束孢I.fumosorosea侵染12 h、18 h、24 h和36 h不同时间段内,有大量的显著差异表达基因。其中,上调基因数分别为119、117、635、197个;下调的基因数分别为747、869、665、837个。在这些差异表达基因中,与小菜蛾主要的免疫信号通路—Toll通路和IMD通路相关的基因共有78个,在这78个基因中,包括11个免疫识别分子,43个通路中的配基,9个家族抗菌肽。其中,作为Toll通路核心组分,有15个具有显著差异的跨膜因子Toll基因。这些结果表明玫烟色棒束孢侵染小菜蛾后诱导了其免疫通路,而且主要是诱导了Toll信号通路,最终诱导产生抗菌肽抵御真菌侵染。在分析DGE数据和小菜蛾基因组数据的基础上,利用RT-PCR和RACE技术克隆了小菜蛾Toll 2、Toll 5和Toll 11基因全长cDNA序列。序列分析表明,Toll 2基因cDNA全长为3008 bp,开放阅读框为2010 bp,编码669个氨基酸,跨膜区域位于462-486 aa,推测其蛋白质分子质量为76.7 kDa,等电点为6.31。序列比对及进化分析表明Toll 2属于Toll-like receptor 6家族。Toll 5基因cDNA全长序列为3497 bp,开放阅读框为2052 bp,编码683个氨基酸,跨膜区域位于434-456 aa,推测其蛋白质分子质量为75.2 kDa,等电点为5.30。序列比对及进化分析表明Toll 5属于Toll-like receptor 8家族。Toll 11基因cDNA全长为4904 bp,开放阅读框为4710 bp,编码1389个氨基酸,跨膜区域位于1321-1343 aa,推测其蛋白质分子质量为159.7 kDa,等电点为5.89。序列比对及进化分析表明Toll11属于Toll-likereceptor8家族。为了进一步阐明小菜蛾Toll家族免疫虫生真菌的作用,本研究采用体壁浸泡的方法,选用三种虫生真菌(玫烟色棒束孢、白僵菌、绿僵菌)的真菌孢子悬浮液107孢子/ml侵染健康小菜蛾3龄幼虫后,在6-48h,取其表皮、脂肪体、血细胞三种组织,通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测表达模式。结果表明同一种真菌处理后的同一种组织中不同基因的表达量存在差异。结果显示玫烟色棒束孢、白僵菌、绿僵菌处理后Toll2、Toll5、Toll11表达量在体壁中表达高峰达到显著差异,也在某些时间段被诱导表达。在血细胞中玫烟色棒束孢处理后,Toll2、Toll5、Toll11无明显的诱导表达;而白僵菌和绿僵菌处理三个Toll基因的诱导表达效果不一致;在脂肪体中三种真菌处理后Toll2、Toll5、Toll11相对表达量存在复杂的动态变化,相较于其他两种组织,在脂肪体中被诱导表达趋势更为明显。以上结果表明,作为Toll通路内部组分的三种Toll基因在受到真菌侵染时表达量在不同时间可能会出现抑制和诱导两种反应,进一步表明调控小菜蛾体内信号通路的因子复杂性。为了探讨小菜蛾Toll2的功能,本研究利用丝状真菌沉默载体psilent-1质粒,构建了小菜蛾免疫基因Toll的rnai载体,通过peg4000介导将干扰载体转入玫烟色棒束孢ifb01菌株原生质体,通过600ug/ml潮霉素b初步筛选和pcr的最终筛选,获得了能够稳定遗传的重组菌株dsToll2。将此重组菌株制备成浓度为10~4、10~5、10~6、10~7孢子/ml的孢子悬浮液,用体壁浸泡法侵染小菜蛾3龄幼虫,每隔24h对4个浓度处理后小菜蛾的存活率进行统计。结果表明,重组菌株浓度为10~4、10~5、10~6孢子/ml的孢子悬浮液处理后存活率为0的时间是第6天,重组菌株浓度为10~7孢子/ml的孢子悬浮液处理存活率为0的时间第5天,而以未改造的10~4、10~5、10~6、10~7孢子/ml的玫烟色棒束孢孢子悬浮液处理小菜蛾在第6天的存活率分别为54.67%、52%、29.33%、22.67%,要使小菜蛾在第5天存活率为0的未改造的玫烟色棒束孢孢子悬浮液的浓度需达到10~9孢子/ml。以上结果表明,重组菌株dsToll2与未改造的玫烟色棒束孢相比较,重组菌株dsToll2对小菜蛾的存活率影响更大,可以显著提高小菜蛾的死亡时间。为了从蛋白水平研究小菜蛾Toll蛋白,本研究构建了原核表达质粒pgex4t-Toll2,在iptg诱导下,表达宿主菌rosetta(de3)中进行了高效表达,sds-page检测表明pgex4t-1-Toll2在大肠杆菌中可表达相对分子质量(mr)为60.0kda的融合蛋白,与预测的融合蛋白的分子大小相当。利用gst纯化标签进一步纯化了Toll2蛋白,并制备了高效价多克隆抗体anti-Toll 2。Western Blot结果显示纯化蛋白条带与兔抗anti-Toll 2血清呈阳性反应。以上结果表明制备的抗血清质量良好,为从蛋白水平上进一步研究Toll 2的结构和功能提供了蛋白资源。综上所述,本研究利用DGE初步探讨了小菜蛾免疫防御玫烟色棒束孢侵染的基因动态表达,RNAi技术初步的阐明了Toll 2参与了昆虫抵抗真菌侵染的免疫反应,调控了抗菌肽基因的表达,本研究结果为以小菜蛾免疫系统为靶标的真菌杀虫剂的开发奠定了理论基础。