视网膜中的感光细胞是视觉形成的第一站——将光信号转变为神经电化学信号。感光细胞的发育或功能缺陷是大多数遗传性视网膜变性疾病患者视力受损的直接原因。探索感光细胞的发育过程和调控机制,对于视网膜变性疾病的发病机制研究和干细胞、再生疗法的建立具有重要意义。神经视网膜亮氨酸拉链（neural retina leucine zipper,NRL）蛋白是大Maf家族的转录因子之一,特异性地在视网膜中表达,可以直接调控视杆细胞光转导相关基因的转录。NRL突变可引起常染色体显性视网膜色素变性和常染色体隐性S视锥功能增强型综合征（enhanced S-cone syndrome,ESCS）。在小鼠中敲除Nrl导致视杆细胞不能正常发育而蓝视锥细胞显著增多,得到类似人类ESCS患者的表型;而在小鼠中过表达Nrl导致视锥细胞向视杆细胞的转化。在斑马鱼中,目前还没有研究nrl基因功能和构建相关动物模型的报道。本文利用CRISPR/Cas9技术成功构建nrl敲除斑马鱼品系,并对斑马鱼nrl基因的功能及其对视杆细胞的发育过程的作用进行探索。通过组织学和免疫荧光分析,发现nrl敲除导致斑马鱼视网膜视杆细胞的数量显著减少和视网膜外节变短。由于nrl非依赖的视杆细胞在基因表达和外节形态等方面存在缺陷,因此推测这些视杆细胞可能随着斑马鱼年龄的增加而最终发生凋亡。脱氧核苷酸末端转移酶介导的d UTP缺口末端标记法检测结果显示,在受精后5个月、8个月和13个月的nrl敲除斑马鱼视网膜中均存在凋亡信号。凋亡的细胞类型包括视杆细胞、视锥细胞、视网膜色素上皮细胞等。上述发现说明,nrl非依赖的视杆细胞会逐渐凋亡并引起其它视网膜细胞的继发性凋亡。通过免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白表达显示nrl敲除斑马鱼中被激活的Muller细胞荧光亮度显著高于野生型斑马鱼,说明nrl敲除斑马鱼中视网膜损伤和变性的程度高于野生型斑马鱼。在nrl敲除斑马鱼中,持续的细胞凋亡（从受精后5个月到13个月）和较高的视网膜压力并没有让其视网膜表型发生明显的恶化。鉴于斑马鱼视网膜具有很强的再生功能,因此推测nrl敲除斑马鱼中再生被激活,弥补了丢失的感光细胞。增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）抗体的免疫荧光结果显示,nrl敲除斑马鱼视网膜中PCNA的荧光信号均明显多于野生型斑马鱼,说明nrl敲除斑马鱼视网膜中再生的活跃程度远远高于野生型斑马鱼。为揭示nrl敲除斑马鱼中视杆细胞的来源,利用Tg（rho:EGFP）转基因荧光斑马鱼对视杆细胞的整个发育过程进行观察,发现nrl敲除斑马鱼在胚胎发育期（受精后3～7天）没有视杆细胞产生,而在幼鱼成长期（受精后7天至成年）视杆细胞又开始逐渐产生,提示斑马鱼中可能存在第一波nrl依赖的和第二波nrl不依赖的两种视杆细胞。nrl非依赖视杆细胞外节显著变短和视杆基因表达显著降低,提示nrl在第二波视杆细胞的形态和功能维持上发挥重要作用。应用蛋白质免疫印迹技术,发现nrl敲除后视杆细胞特异性基因（rho、gnat1和gnb1）的蛋白水平显著下降,而视锥细胞特异性基因（gnat2和gnb3）的表达则呈逐渐上升的趋势。提示在nrl敲除斑马鱼中可能存在视杆细胞向视锥细胞的转化。利用实时定量聚合酶链式反应技术对四种视锥细胞视蛋白的m RNA水平进行检测,发现绿视锥视蛋白的m RNA水平大幅度上升。免疫荧光分析发现nrl敲除斑马鱼中绿视锥细胞的数量确实显著增多,表明nrl敲除可能主要引起第二波视杆细胞命运向绿视锥细胞的转化。此外,还发现nrl敲除斑马鱼的视杆细胞中存在错误表达的绿视锥视蛋白,提示nrl可能在视杆细胞中发挥抑制视锥基因表达的作用。综上所述,本文在斑马鱼中敲除了nrl基因,发现nrl敲除斑马鱼的视网膜发育的特殊表型,并进一步对其形成机制进行探讨。本研究对于揭示斑马鱼中nrl的基因功能、视杆细胞的发育调控机制、感光细胞的凋亡与再生机制等具有重要的意义。这一研究也为未来以斑马鱼为动物模型开展视网膜变性疾病的发病机制和治疗研究提供基础和新思路。