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目的：基于“肾藏精.主骨生髓”理论.本实验采用血清药理学的方法,研究左归丸对小鼠成骨前体细胞系MC3T3一E1Subclone14细胞增殖和分化的作用,从ERK1/2信号通路途径探讨左归丸对成骨细胞的作用机制,并进一步阐释ERK1/2信号通路和「GF-β1/Smads信号通路在左归丸干预成骨细胞中的交联作用。材料与方法：SPF级SD雌性大鼠154只,180～200g.按体重随机分层,每层按数量比分为五组：空白对照组(Control)30只,左归丸高、中、低剂量组[ZG(H、M、L)]各31只,倍美力组(BML)31只。根据等临床剂量换算进行灌胃给药：左归丸各剂量组灌服左归丸各剂量混悬液BML组灌服结合雌激素,Control组灌服蒸馏水,2次·d-1,持续灌胃7d。于第8d给药2h后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,大鼠腹主动脉取血.室温静置2h.2500rpm,4℃离心20min,收集血清,同组混匀,56℃水浴灭活30min,经0.22μm滤膜抽滤除菌,1.5mlEP管分装,-86℃保存。使用前用无血清α-MEM稀释至所需浓度,4℃保存备用。采用MTT法筛选左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞干预的有效剂量和有效作用时间：用ERK1/2特异性阻滞剂PD98059干预后.采用MTT法检测ERK1/2信号通路对MC3T3-E1细胞增殖的影响：采用改良钙钴染色法检测ERK1/2信号通路对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(ALP)表达的影响：采用茜素红染色法检测ERK1/2信号通路对MC3T3-E1细胞钙化结节的影响：采用Real Time RT-PCR法检测ERK1/2信号通路对MC3T3一E1细胞核结合因了α1(Cbf α1)、Ⅰ型胶原(COL Ⅰ)、转化生长因了β1(TGF-β1)、Smad4和Smad2mRNA表达的影响：采用Western blotting法检测ERK1/2信号通路对MC3T3一E1细胞Cbf α1、COL Ⅰ、TGF-β1、Smad4、ERK1/2和(?) p-ERK1/2蛋白表达的影响。结果：1左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞增殖的影响左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞的促增殖作用呈剂量和时间相关性。体积分数为15%的ZG(H、M、L)含药血清对MC3T3-E1细胞的促增殖作用均明显高于10%和20%的作用。其中.以15%的ZG(L)含药血清作用48h后对MC3T3-E1细胞的促增殖作用最强(P<0.01),且与Control组比较,有显著性差异(P<0.05).与BML组比无显著差异。故,采用15%的ZG(L)含药血清(以ZG(L)表示)进行细胞干预实验。ZG(L)含药血清以体积分数为15%作用于MC3T3-E1细胞48h后,与Control组比,细胞增殖显著升高(P<0.01),与BML组比较无显著性差异PD98059能显著抑制ZG(L)对细胞的促增殖作用(P<0.0I)。2ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞分化的影响2.1ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞ALP的影响细胞合成的ALP经改良钙钴法染色,呈棕黑色细微颗粒,阴性对照组无棕黑色颗粒。结果显示,与Control组比,ZG(L)含药血清作用于MC3T3-E1细胞14d后,细胞密度增大,细胞突触多且长,棕黑色颗粒增多。加入PD98059后,ZG(L)组和BML组与未加组比较,细胞密度降低,细胞突触回缩,棕黑色颗粒沉积减少。2.2ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞钙化结节的影响形成的钙化结节经茜素红染色呈红色。结果显示,与Control组比,ZG(L)含药血清作用于MC3T3-E1细胞14d后,钙化结节明显增多。加入PD98059后,ZG(L)组和BML组与未加组比较,钙化结节明显减少。2.3ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞Cbf α1、COL Ⅰ mRNA和蛋白表达的影响与Control组比较,ZG(L)显著上调MC3T3-E1细胞Cbfα1、COL Ⅰ mRNA(P<0.01)和蛋白表达(P<0.05)。加入PD98059后,ZG(L)组和BML组与未加PD98059比较.Cbfα1、 COL Ⅰ mRNA和蛋白表达均显著下调(P<0.05)。3左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞ERK1/2和TGF-β1/Smads信号通路的作用3.1左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞ERK1/2蛋白的磷酸化作用与Control组比.ZG(L)能明显诱导MC3T3-E1细胞ERK1/2蛋白的磷酸化,且强于BML组(P<0.01)。加入PD98059后,ZG(L)组和BML组较未加PD98059组对ERK1/2蛋白磷酸化的诱导作用明显减弱(P<0.05)。3.2ERK1/2信号通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1细胞TGF-β1、Smad4mRNA和蛋白Smad2mRNA表达的影响与Control组比,ZG(L)与BML均能显著上调MC3T3-E1细胞TGF-β1、Smad4mRNA和蛋白、Smad2mRNA表达(P<0.05或P<0.01)：加入PD98059后.ZG(L)及BML组较未加PD98059组比较,Smad4mRNA和蛋白、Smad2mRNA表达明显下降(P<0.05或P<0.01);TGF-β1mRNA表达进一步上调,且有显著差异(P<0.05).TGF-β1蛋白表达有上升趋势,无显著差异。结论：1左归丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞的增殖与分化。2ERK1/2信号通路参与了MC3T3-E1细胞增殖与分化。3左归丸通过ERK1/2(?)信号通路调控成骨细胞的增殖与分化,这可能是「GF-β1/Smads左归丸有效防治骨质疏松症的机制之一。