论文部分内容阅读
非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)是最难治愈的男性不育症之一,发病机制尚不明确。近年来,随着生物信息学和微阵列分析技术的发展,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)的功能研究得到越来越多学者的关注,ncRNA现已被证明广泛地参与多种疾病的发生发展过程。我们前期的研究发现在NOA患者睾丸组织中低表达水平的miR-188-3p可以通过其靶基因MLH1,导致生精细胞凋亡增加,从而参与NOA的发生。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)为一类长度大于200kb的调控性非编码RNAs。研究发现lncRNAs通过与信使RNA(messageRNA,mRNA)竞争性结合和吸附miRNA可进行相互调控,影响疾病的发生发展。结合我们前期的研究,进一步通过高通量测序检测NOA睾丸组织和正常睾丸组织间差异表达的lncRNAs和mRNAs,并经过生物信息学方法分析显示:差异表达的lncRNA母系表达基因3(maternally expressed gene3,MEG3)和自噬相关基因7(autophage related gene 7,ATG7)与miR-188-3p可能存在潜在结合位点。lncRNA MEG3是一种母系印迹基因,近年来关于其研究主要集中于肿瘤方面,结果显示在肿瘤细胞中低表达水平的lncRNA MEG3抑制肿瘤细胞凋亡。而关于lncRNA MEG3与精子发生的研究较少,其功能及机制的研究尚未见报道。ATG7基因作为一种mRNA,在自噬发生过程中起重要作用。有研究报道miR-188-3p可通过靶向作用ATG7基因,抑制小鼠心肌细胞发生自噬性死亡。也有研究报道ATG7基因在小鼠精子顶体发育过程中起重要作用。但是目前关于其与无精子症的研究尚未见报道。结合以上研究进展,本研究提出假说:lncRNA MEG3通过竞争性结合miR-188-3p,调节ATG7基因的表达水平,从而影响NOA的发生。目的:验证高通量测序结果,并深入探讨lncRNA MEG3能否通过竞争性结合miR-188-3p调控ATG7基因的表达,从而影响NOA发生。旨在为临床NOA的治疗提供新的思路和理论基础。方法:1.实验分组:睾丸组织分组为NOA组(20例)和正常组(生精功能正常的男性患者,20例)。细胞实验分组为过表达/抑制miR-188-3p组和未过表达/未抑制miR-188-3p组(对照组)。2.通过高通量测序技术筛选3例NOA患者睾丸组织与3例有正常生育能力的前列腺癌患者切除的睾丸组织间差异表达的lncRNAs和mRNAs,根据测序结果和生物信息学的分析,预测与miR-188-3p存在潜在结合位点并差异表达的lncRNAs 和 mRNAs。3.通过RT-qPCR等方法检测lncRNA MEG3和ATG7基因在NOA组与正常组中的表达;原位杂交法鉴定lncRNA MEG3在睾丸组织的定位和NTERA-2细胞中的亚定位;免疫组化法鉴定ATG7基因在睾丸组织中的表达和定位。4.采用miR-188-3p的模拟物(mimic),抑制物(inhibitor)以及对应的阴性对照(negative control)转染NTERA-2细胞,RT-qPCR,westem-blot检测miR-188-3p对lncRNAMEG3和ATG7基因的调控结果。结果:1.高通量测序结果显示:NOA组和正常组间差异表达的lncRNAs共122个、差异表达的mRNAs共109个;生物信息学分析发现:13个差异表达的lncRNAs与miR-188-3p具有潜在结合位点,其中以lncRNAMEG3表达水平差异最显著。5个差异表达的mRNAs与miR-188-3p具有潜在结合位点,其中ATG7基因为细胞自噬过程中的关键基因。2.与正常组比较,NOA组中lncRNA MEG3和ATG7基因表达水平显著升高(P<0.05)。3.lncRNA MEG3在正常睾丸组织中各级细胞的细胞质和细胞核均有定位;在NTERA-2细胞的细胞质和细胞核中均有定位,且主要定位于细胞质。ATG7蛋白只定位于各级生精细胞的细胞质中,且ATG7蛋白在NOA组中的表达显著高于正常组(P<0.05)。4.过表达miR-188-3p后,lncRNA MEG3和ATG7基因的表达均显著低于对照组(P<0.05);抑制miR-188-3p后,lncRNA MEG3和ATG7基因的表达均显著高于对照组(P<0.05)。结论:1.lncRNA MEG3和ATG7基因在各级生精细胞中均有定位且在NOA组中高表达,提示其可能参与NOA的发生过程。2.lncRNA MEG3和ATG7基因的表达与miR-188-3p呈负相关,提示lncRNA MEG3可能参与miR-188-3p对ATG7基因的表达调控作用。