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以葡萄砧木品种F-242’(Fercal,Berl.ColombardNolA×333EM)带芽新梢和酿酒葡萄品种‘霞多丽’(VitisVinifera(L.),Chardonnay)胚性细胞团为材料,初步建立了葡萄砧木品种F-242’离体茎段再生体系,酿酒葡萄品种‘霞多丽’胚性细胞悬浮系和遗传转化体系,为进一步研究葡萄的遗传转化和进行葡萄转基因育种提供了理论依据和技术支持。
以葡萄砧木品种F-242’带芽新梢为材料,研究了消毒时间,激素种类及其浓度配比,基本培养基对外植体生根的影响。结果表明,消毒时间长短对葡萄无菌繁殖系的建立影响很大,75%乙醇15s,结合0.1%的升汞8min为葡萄砧木品种‘F-242’最佳的外植体消毒时间。附加生长素类物质IAA和IBA可以明显促进‘F-242’外植体生根,且IAA处理的综合效果要明显优于IBA,IAA的最佳附加浓度为0.1mg/L。不同的基本培养基对葡萄品种F-242’外植体生根影响显著。其中在MS基本培养基上培养的外植体生根率为最高。
以葡萄砧木品种‘F-242’试管苗为材料,研究了外植体类型(叶片、茎段、叶柄),激素种类及其浓度配比,基本培养基、暗培养时间对不定芽诱导的影响。结果显示,以茎段为外植体的不定芽诱导率为最高,其次是叶柄。茎段的最适培养基为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.05mg/L,诱导率最高可达30%。前期暗处理对不定芽的诱导影响显著,2周为最佳的暗培养时间。
以‘霞多丽’胚性细胞团为材料,初步建立了‘霞多丽’悬浮系,并研究了不同激素及其浓度配比,不同种类及浓度的碳源以及谷氨酰胺对悬浮细胞生长的影响。结果表明,2,4-D和NOA均可以抑制胚性细胞的分化,但2,4-D更有利于细胞的增殖,最佳的2,4-D附加浓度为1mg/L。同等浓度的麦芽糖比蔗糖更利于细胞的生长,15g/L为霞多丽胚性悬浮细胞生长的最佳蔗糖浓度。附加谷氨酰胺可以显著提高悬浮细胞的生长,其中以500mg/L为最佳。
以‘霞多丽’胚性悬浮细胞为材料,利用农杆菌介导法,开展了遗传转化体系的建立工作。通过对农杆菌菌液的浓度及侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度、共培养时间等进行深入研究,初步建立了‘霞多丽’胚性悬浮细胞遗传转化体系。结果表明,以OD600=0.6的农杆菌侵染‘霞多丽’胚性悬浮细胞10min,获得了最佳的遗传转化率。AS可以有效提高转化效率,100μmol/L是其最佳的附加浓度。共培养时间的确定是遗传转化的关键,其中以共培养2d效果最佳。