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抗原特异性细胞毒性T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的鉴定是研究CTL疫苗的基础。定量分析抗原特异性T细胞能为免疫应答的发生过程提供重要的信息。传统的鉴定方法费时费力,敏感性低,近年来出现了一种新的检测方法,即可溶性HLA肽四聚体方法。实验表明,该方法克服已有检测手段的缺点和局限性,这种四价的重组分子在体外可有效标记T细胞抗原识别受体(TCR),并适用于流式细胞仪检测CTLs,由于该技术应用原核表达重组蛋白,其来源容易,仅需不同的抗原肽就可制备重组分子,因此近期得到了广泛应用。本实验旨在国内率先建立可溶性HLA-A2-CEA四聚体检测系统,为肿瘤的细胞免疫机制研究提供一个方便、准确的研究平台。研究内容如下:一、PCR-SSP结合测序分析快速筛选HLA-A*0201亚等位基因成功建立相对简单经济的检测HLA-A*0201等位基因的方法,利用位点特异性引物进行2-3次PCR扩增,结合PCR产物测序即可快速筛选HLA-A*0201阳性的个体,满足我们所构建的HLA-A2表位肽四聚复合物检测系统进一步实验的需要。本研究不仅创建了筛选特定等位基因——HLA-A*0201的方法,同时也为快速检测其它特定HLA等位基因提供了经济实用的模式,具有较高的实际应用和参考价值。二、可溶性HLA-A2-CEA四聚体复合物的构建在成功地扩增了HLA-A*0201两个亚单位(重链、轻链)后,将可生物素化的序列连接到HLA-A2重链胞外区末端,分别构建成可溶性重组分子,进行原核表达。再利用6×Histiding tag进行蛋白纯化,在对HLA-A2分子高亲和力的CEA694-702(癌胚抗原优势T细胞表位多肽GVLVGVALI)存在下,三者体外折叠成具有完整构象的HLA-A2-CEA分子复合物。以BirA酶作用于复合物中的融合于HLA重链蛋白C端BSP中的赖氨酸残基,生物酰化该复合物。生物酰化的HLA肽复合物与藻红蛋白(PE)标记的亲和素以4:1结合,形成均一的四聚体结构。利用Streptavidin-shift assay检测到生物素化效率达到90%以上,同时间接ELISA实验证实了可溶性HLA-A2-CEA四聚体中各单体复合体的活性,初步完成了可溶性HLA-A2-CEA四聚体的结构及功能的鉴定工作,为进一步研究肿瘤细胞免疫功能奠定了良好的基础。