研究背景皮肤是人体面积最大的器官,覆盖全身,发挥着保护、感觉、调节体温、分泌与排泄、吸收、代谢、免疫等作用。作为人体的第一道屏障,皮肤直接与外界接触,各种物理、化学、生物等因素都能引起皮肤的损伤,不及时有效治疗会给患者带来极大痛苦,甚至威胁生命。对于皮肤缺损,传统的治疗方法是进行皮肤移植或皮瓣移植术,但存在供体不足和免疫排斥等问题。组织工程皮肤(Tissue Engineering Skin,TES)是将种子细胞与细胞外基质替代物混合制成的人工皮肤,可用于创面修复,重建皮肤功能,具有良好的发展前景。现在已能制备比较成熟的表皮-真皮组织工程皮肤,基本能够快速覆盖创面,但是缺乏毛囊等皮肤附属器。毛囊含有丰富的毛囊干细胞,在皮肤创伤的修复、重建中有重要作用。毛囊所生长出的毛发除了调节体温、分泌与排泄等基本功能之外,对于人类还有影响美观,进而进一步影响心理及社交的作用。构建有毛发生长能力的组织工程皮肤不但能促进皮肤损伤修复,还可以重建皮肤功能,而且对于脱发等疾病有一定治疗作用。研究目的1.观察毛囊胚胎发育及毛囊干细胞动态衍变过程,探讨毛囊的发生、发展过程,为寻找有诱导毛发形成能力的种子细胞提供依据。2.掌握体外构建表皮-真皮组织工程皮肤的技术及明确移植后的体内转归,探讨表皮-真皮组织工程皮肤的皮肤缺损修复以及毛发生长能力。3.寻找具有诱导毛发形成能力的种子细胞,明确其能维持诱导能力的培养方式及构建方式,为构建有毛发生长能力的组织工程皮肤奠定基础。4.构建有毛发生长能力的组织工程皮肤并修复皮肤缺损。研究方法1.以C57BL/6不同胎龄胎鼠的皮肤为模型,通过HE染色观察毛囊胚胎发育过程,免疫荧光染色标记相关毛囊干细胞并观察毛囊干细胞动态衍变过程。2.分离、培养儿童包皮表皮细胞及真皮成纤维细胞,以自制SD大鼠鼠尾胶原为基质,应用气-液面培养,构建表皮-真皮组织工程皮肤。制备大鼠背部急性全层皮肤损伤模型,将构建的表皮-真皮组织工程皮肤覆盖伤口,观察其体内转归。将原代培养的成人毛乳头细胞与成人毛囊干细胞以上述方式制备组织工程皮肤,并进行体内移植观察其转归。3.将新鲜分离的C57BL/6新生鼠(24小时以内)真皮细胞、贴壁培养的原代真皮细胞、悬浮培养的原代真皮细胞以及悬浮培养后吹打成单细胞悬液,和表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部制备的皮肤全层缺损处,三周后观察毛发生长情况并组织学染色观察毛囊结构。将C57BL/6成鼠胡须毛乳头细胞P1代与新鲜分离的新生鼠表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,植入C57BL/6小鼠肾外膜下,三周后进行观察。4.将成人头皮来源毛乳头细胞、儿童包皮成纤维细胞、人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞分别复合儿童包皮表皮细胞为种子细胞,进行2D或3D的构建及培养方式,将其移植裸鼠体内,验证不同种子细胞毛发形成能力的异同,寻找能稳定诱导毛发形成的种子细胞。5.以儿童包皮来源的表皮细胞和成纤维细胞为种子细胞,使用3D打印的方法在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层中打印毛囊样3D结构,构建有毛发生长能力的组织工程皮肤;此外,还以人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞混合儿童包皮来源的表皮细胞为种子细胞直接构建有毛发生长能力的组织工程皮肤;将构建的组织工程皮肤移植裸鼠体内修复皮肤缺损并观察有无毛发生长能力。研究结果1.毛囊胚胎发育及相关毛囊干细胞动态衍变过程(1)HE染色显示:C57BL/6小鼠从胚胎发育E14.5天开始出现表皮局部增厚,形成基板,真皮细胞在下方聚集;E15.5天增厚的表皮细胞逐渐形成毛芽,基板下方聚集的真皮细胞开始被形成的毛芽包裹;E16.5-E17.5天毛芽进一步发育,真皮细胞逐渐被毛芽包裹,形成毛囊的毛乳头结构;E18.5天至出生后,继续完成毛囊的胚胎发育,出生时毛囊的结构基本形成。(2)毛囊干细胞免疫荧光标记显示:随着毛囊发育和延长,标记的毛囊干细胞呈时空动态表达。2.体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤(1)体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤气-液面培养5天后,HE染色可观察到表皮和真皮两层结构,且表皮呈现复层化。表皮细胞及成纤维细胞状态良好,分布均匀。胶原蛋白交织成网将成纤维细胞固定在基质中。移植3周后,皮肤创口处完全愈合,与周围组织紧密连接,未见毛发;组织学显示缺损处皮肤形成表皮、真皮双层结构,且表皮复层化,未见毛囊结构。(2)将原代培养的成人毛乳头细胞与成人毛囊干细胞以上述方式制备的组织工程皮肤植入裸鼠体内三周后也未见毛发生长,组织学染色观察未见毛囊结构。3.寻找具有诱导毛囊形成能力的种子细胞(1)新鲜分离的C57BL/6新生鼠真皮细胞和表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部制备的皮肤全层缺损处三周后可见黑色毛发生长。(2)贴壁培养的原代真皮细胞组,三周后未见毛发生长,组织学染色未见毛囊结构;而在悬浮培养的原代真皮细胞组,三周后可见黑色毛发生长;悬浮培养的原代真皮细胞吹打成单细胞悬液组,三周后无毛发生长。提示3D悬浮培养可保留新生鼠原代真皮细胞的诱导毛发形成能力。(3)C57BL/6成鼠胡须毛乳头细胞P1代与新鲜分离的新生鼠表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,植入C57BL/6小鼠肾外膜下三周后可见黑色毛发生长,组织学染色观察见毛囊结构。(4)成人毛乳头细胞P1与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,移植至裸小鼠背部皮肤皮下观察3周,见白色毛纤维生长。(5)儿童包皮成纤维细胞P1与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,移植至裸小鼠背部皮下观察3周,见白色毛纤维生长。植入皮内,导丝引导,三周后有白色毛纤维长出,经线粒体DNA检测毛发含有人类源性的DNA。(6)人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞、新鲜分离的新生鼠表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部皮下能长出黑色毛发。人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞、新鲜分离的儿童包皮来源表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部皮下能长出黑色毛发。4.构建带有毛囊的表皮-真皮组织工程皮肤(1)使用3D打印方法在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层中打印含儿童包皮来源表皮细胞和成纤维细胞的毛囊样3D结构,将构建的组织工程皮肤移植到裸鼠背部全层皮肤缺损处,三周后可见白色毛发。(2)人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞混合制备组织工程皮肤,皮下移植及移植到裸鼠背部全层皮肤缺损处,三周后可见黑色毛发。研究结论1.毛囊胚胎发育及相关毛囊干细胞动态衍变过程毛囊胚胎发育进一步确认了毛囊的胚胎发育是表皮细胞与真皮细胞相互作用的结果,E14.5-E17.5是C57BL/6毛囊形态学发育的关键时间。2.构建表皮-真皮组织工程皮肤(1)体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤经气-液面培养5天后呈现表皮、真皮双层结构,表皮呈现复层化。体外移植至裸鼠全层皮肤创伤模型能使皮肤创口的愈合良好。(2)培养的人毛乳头细胞以单细胞的方式接种于真皮层中表皮-真皮组织工程皮肤体内移植后不具备形成毛发的能力。3.寻找能够诱导毛发形成的种子细胞(1)能够诱导毛发形成的细胞制备成类似毛囊样3D结构,并经3D培养后,可较好的维持其诱导毛囊形成的能力。(2)儿童包皮的成纤维细胞与表皮细胞制备成类似毛囊样的3D结构具有诱导毛发形成的能力,但是所生长出的毛发不含黑色素。(3)人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞具有良好的诱导毛发形成的能力,并且长出的毛发是含黑色素的。4.构建带有毛囊的表皮-真皮组织工程皮肤(1)使用3D打印机将能诱导毛发形成的种子细胞在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层上接种成含种子细胞的3D结构,体内移植3周后可构建带有白色毛发的表皮-真皮组织工程皮肤。(2)人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞与新鲜分离的儿童包皮细胞制备成表皮-真皮组织工程皮肤皮下移植及移植到裸鼠体内,可构建带有黑色毛发的表皮-真皮组织工程皮肤。