论文部分内容阅读
CircRNAs是一种共价闭合单链的环状RNA,不易被核酸酶降解,可参与基因表达的调控。目前在古细菌、植物、动物和人类在内的各种生物体中已经成功识别出大量circRNAs,也发现部分DNA病毒的转录本可以通过反向剪接形成功能性的circRNAs。我们曾通过高通量测序发现分节段的双链RNA病毒-家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV）可以形成 circRNA,其中circRNA000048序列与BmCPV基因组S5 dsRNA正义链164-1245 nt区域的序列一致。本研究在进一步证实BmCPV circRNA000048真实存在的基础上,重点探讨了 circRNA000048的形成机制及其编码的小肽vsp21通过NF-κB/自噬通路延缓病毒复制的机制,取得的主要研究结果如下:1 circRNA000048 的真实性为了确认BmCPV产生的circRNA000048的真伪,我们提取BmCPV感染的家蚕中肠的RNA,利用发散引物进行反转录PCR,反转录PCR产物的Sanger测序结果显示,circRNA000048的junction site及其旁侧序列与高通量circRNAome测序结果一致,进一步通过反转录滚环扩增（reverse transcription-rolling circle amplification,TCA）对circRNA000048进行鉴定,扩增产物的电泳和Sanger测序结果证实circRNA000048为环状分子,其junction site和完整序列与高通量circRNAome测序结果一致;尔后,利用靶向junction site的寡核苷酸探针进行Nothern blotting以及原位杂交实验,在BmCPV感染的家蚕中肠及BmN细胞中检测到阳性信号,进一步证实BmCPV可形成circRNA000048。2 circRNA000048 延缓 BmCPV 增殖复制为了探明circRNA000048是否具有功能及其对BmCPV增殖复制的影响,通过 qRT-PCR、Western blotting 和 TCID50 检测过表达 circRNA000048 和敲降circRNA000048表达后对BmCPV增殖复制的影响,结果显示按不同剂量转染pIZT-LcR-circRNA000048后,病毒vp1、nsp5的基因表达水平、VP7的蛋白表达水平、病毒滴度均呈剂量依赖性降低,而按不同剂量敲降circRNA000048表达后,病毒vp1、vp2的基因表达水平、病毒滴度均呈剂量依赖性升高,表明circRNA000048可延缓BmCPV增殖复制。3 circRNA000048可通过与bmo-miR-2753互作激活METT20的表达circRNA可作为miRNA和RNA结合蛋白的海绵体,调控宿主基因和病毒基因的表达水平。生物信息学分析发现,circRNA000048可与bmo-miR-2753互作,家蚕 electron transfer flavoprotein beta subunit lysine methyltransferase 基因（LOC101742711,METT20）的 3’-UTR 1351-1372 nt 区域存在 bmo-miR-2753 的结合位点,为明确它们之间的互作关系,首先利用靶向circRNA000048 junction site的生物素标记的探针通过pull down实验证实circRNA000048可吸附bmo-miR-2753;尔后,利用 qRT-PCR 检测转染不同剂量的pIZT-LcR-circRNA000048质粒后METT20基因表达水平,结果显示,METT20表达水平呈剂量依赖性升高;进一步,构建了萤火虫荧光素酶表达载体pOtu-Luc-METT20和pOtu-Luc-mut（突变对照）,通过双荧光素酶报告基因系统证实,circRNA000048可通过bmo-miR-2753来激活下游靶基因METT20的表达。上述结果证明BmCPV可编码功能性的circRNA000048。4形成circRNA000048的顺式作用元件真核生物和DNA病毒的circRNAs多数都有典型的GU/AG剪接信号,并通过反向剪接的方式形成。然而,在BmCPV的许多circRNAs的junction site存在非GU/AG剪接信号,包括circRNA000048,说明该circRNA的形成方式不同于细胞内源性circRNA。为了探明形成circRNA000048必须的顺式元件,首先我们构建了 circRNA mini检测载体,以circRNA000048的5’-切割位点和3’-切割位点上、下游100 nt为旁侧序列,中间插入来源于绿色荧光蛋白基因的长度100 nt序列,并用T7启动子控制上述序列构建mini-vector-FS100,用circRNA000048的5’-切割位点和3’-切割位点上、下游50、25、15nt为旁侧序列,以同样方式构建mini-vector-FS50、mini-vector-FS25、mini-vector-FS15,利用 T7 RNA 聚合酶体外转录获得相应的RNA,并转染BmN细胞,利用发散引物进行PCR和PCR产物Sanger测序检测circRNA的形成,通过荧光定量PCR检测circRNA的形成效率,结果显示来源 mini-vector-FS100、mini-vector-FS50、mini-vector-FS25 的 RNA 可形成circRNAs,且形成效率依次降低,但没有检测到mini-vector-FS15的RNA形成的circRNA。circRNA000048的5’-切割位点和3’-切割位点均含有一个AGAG序列,但仅有一个AGAG序列保留在circRNA000048中。当将mini-vector-FS100中的“AGAG”序列缺失构建 mini-vector-FS100-delete,将 mini-vector-FS25 中的“AGAG”突变成“GCGA”时,circRNA的形成能力下降1000倍,说明circRNA000048的5’-切割位点和3’-切割位点上、下游25 nt序列以及“AGAG”序列是circRNA000048形成的关键顺式元件。将mini-vector-FS100 RNA转染BmN细胞,分别在转染后3、6、12和24 h提取总RNA,利用内敛引物进行RT-PCR,扩增产物的Sanger测序结果显示,形成circRNA后的余下的两侧区域以类似于mRNA的成熟方式拼接形成新的线性RNA。5与circRNA000048形成相关的蛋白位于细胞质中细胞内源性circRNA在细胞核内以back-splicing的方式形成。为了探讨circRNA000048在细胞中的形成部位,将mini-vector-FS100 RNA分别与胞浆、胞核蛋白孵育,用发散引物PCR检测circRNA的junction site,结果显示,在与胞浆孵育的样本中可检测到circRNA,但胞核蛋白孵育的样本中没有检测到,推测circRNA000048在细胞质中形成。我们假定circRNA000048形成方式可能以类似于古细菌circRNA或线粒体circRNA,即病毒RNA被细胞内某种RNA酶切割后,再由RNA连接酶环化连接形成。因此通过RNAi分别抑制ribonuclease P（LOC693087）、tRNA-splicing ligase RtcB homolog（XP004924840.1）、ribonuclease Z（LOC101744488）和 ATP-dependent RNA helicase spindle-E（LOC101743633）基因的表达,探讨其对circRNA000048形成的影响,结果显示下调上述基因的表达对circRNA000048形成没有影响。进一步,用来源于mini-vector-FS100 的线性 RNA 分子 mini-100、circRNA 分子 circmini-100 以及 GFP的circRNA分子circGFP通过RNA免疫共沉淀筛选与circRNA000048形成相关的胞浆蛋白,质谱鉴定结果显示,异质核糖核蛋白Q（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q,hnRNPQ）、protein LSM14 homolog B isoform X4、double-stranded RNA-binding zinc finger protein JAZ、leucine-rich repeat-containing protein 47、DEAD box polypeptide 5 isoform 2（DDX5 isoform 2）等 RNA 结合蛋白有可能参与circRNA000048的形成。当用siRNA敲降感染BmCPV的BmN细胞中的hnRNPQ和DDX5 isoform 2基因表达水平,circRNA000048形成效率明显降低,表明hnRNPQ和DDX5 isoform 2可能参与circRNA000048的形成。6 circRNA000048可翻译延缓病毒增殖复制的vsp21和vsp34小肽生物信息学分析发现circRNA000048具有编码小肽的开放读码框,为了证实circRNA000048编码小肽,我们化学合成推测的小肽制备抗体,通过Western blotting和质谱分析证实BmCPV感染的细胞、家蚕中肠组织和转染circRNA000048表达载体pIZT-LcR-circRNA000048的细胞中均可检测到分别由21和34个氨基酸残基构成的病毒小肽21（virus small peptide 21,vsp21）和病毒小肽 34（virus small peptide 34,vsp34）。用红色荧光蛋白（DsRed）基因替代 vsp21开放读码框构建表达载体pIZT-LcR-circRNA000048-DsRed,细胞转染实验证实pIZT-LcR-circRNA000048-DsRed 可翻译 DsRed。qRT-PCR、Western blotting 和病毒滴度检测证实vsp21和vsp34均可延缓BmCPV的增殖复制。为了探讨circRNA000048翻译vsp21的可能机制,我们用vsp21开放读码框上游推测的139 bp的内部核糖体进入位点（internal ribosomal entry site,IRES）控制荧光素酶基因,通过双荧光素酶报告基因系统证实该推测的IRES具有启动翻译活性。进一步,我们设计了针对circRNA000048接头位点区域的siRNA circRNA-siRNA,以及针对circRNA000048 的线性分子的 siRNA（siRNA-linear-1 和 siRNA-linear-2）,并通过荧光定量PCR以及Western blotting证明vsp21由circRNA000048翻译产生的,而非由它的线性亲本RNA翻译形成。7 circRNA000048延缓病毒的增殖复制可能归因于vsp21为了探讨circRNA000048延缓病毒的增殖复制主要通过其核酸分子还是通过其编码的小肽发挥作用,将circRNA000048表达载体中vsp21的起始密码AUG突变成 TCG 构建 pIZT-LcR-circRNA000048 mut,通过 qRT-PCR、Western blotting和TCID50检测其对BmCPV增殖复制的影响,结果显示,后者延缓病毒增殖复制的能力低于前者,推测circRNA000048延缓病毒的增殖复制可能归因于vsp21。8 vsp21 与泛素 C-末端水解酶（Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase,UCH）互作通过NF-κB/autophagy axis调控病毒增殖复制为了探明vsp21延缓病毒增殖复制的作用机制,通过pull-down和Co-IP证实vsp21可与UCH互作;进一步通过IP和Western blotting检测发现vsp21可与p-IκB-α竞争性结合UCH,促进p-IκB-α泛素化,促进NF-κB（p65）入核,激活NF-κB信号通路。vsp21处理细胞可提升LC3B-Ⅱ的蛋白表达水平和自噬相关基因BmATG5、BmATG8、BmATG12的表达水平,说明vsp21可诱导细胞自噬。进一步通过雷帕霉素（自噬诱导剂）、3-甲基腺嘌呤（自噬抑制剂）和Bay1l-7082（NF-κB的特异性抑制剂）与vsp21组合处理细胞实验以及vsp21和UCH共表达实验证实vsp21可通过激活NF-κB信号通路、诱导自噬负调控病毒的增殖复制。9 vsp21通过诱导ROS产生激活NF-κB通路延缓病毒增殖复制本研究还发现vsp21可提高活性氧（Reactive Oxygen species,ROS）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平,降低超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、线粒体膜电位、谷胱甘肽过氧化物酶1（Glutathione peroxidase 1,GSH-Px 1）水平,与单独vsp21处理BmCPV感染细胞相比,vsp21和ROS的抑制剂NAC共处理BmCPV感染细胞的NF-κB（p65）入核减少,病毒VP7蛋白表达水平升高,说明vsp21可通过ROS激活NF-κB通路延缓病毒的增殖复制。这些结果明确了vsp21延缓病毒增殖复制的机制,加深了 BmCPV复制调节机制的理解。综上,circRNA000048可以编码延缓BmCPV增殖复制的小肽vsp21和vsp34,发现vsp21可通过诱导ROS产生、竞争性结合UCH蛋白促进p-IκB-α泛素化、激活NF-κB信号通路和自噬负调控病毒的增殖复制。研究结果探明了circRNA000048编码的vsp21的功能和作用机制,为理解BmCPV基因组信息、BmCPV形成circRNA的机制、病毒增殖复制的调节提供了新线索。