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第一部分通过转基因方法探究hKLK1对高同型半胱氨酸血症大鼠勃起功能的影响目的:针对转基因大鼠(Transgenic rat,TGR)中人组织缓激肽释放酶1(Human tissue kallikrein 1,hKLK1)基因表达进行鉴定;将TGR引入建立高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocystenimia,HHcy)大鼠模型,检测大鼠阴茎勃起功能,从而评估hKLK1对HHcy大鼠勃起功能的影响。方法:在本研究中,我们所使用的遗传稳定的TGR(hKLK1)为德国柏林Max-Delbrück分子医学中心所构建和馈赠。该实验室构建TGR的方法简要总结如下:准备一段5.6kb长含有完整hKLK1基因的DNA片段以及用于实验的Sprague-Dawley(SD)大鼠的卵细胞,在重金属敏感小鼠金属硫蛋白启动子的控制下将DNA显微注射到卵细胞中,之后用Southern blot法检测该基因的存在,纯合子转基因大鼠用于后续繁衍及实验。我们利用在食物中添加甲硫氨酸(Methionine,Met)的方法建立HHcy大鼠模型。我们将30只10周龄健康雄性SD大鼠随机分为3组(每组10只):野生正常组(Control),低剂量Met诱导组(4%Met),高剂量Met诱导组(7%Met);另取10只相同饲养条件同龄TGR雄性大鼠组成转基因+高剂量Met诱导组(TGR+7%Met)。造模前后检测各组大鼠体重及血液中同型半胱氨酸(Homocystenimia,Hcy)水平。造模1月后采用不同电压参数下电刺激大鼠海绵体神经诱导阴茎勃起的方法检测大鼠海绵体内压(Intracavernous pressure,ICP),同时使用大鼠左侧颈动脉插管方法监测平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP)的变化。最终通过计算ICP峰值/MAP以及ICP曲线下面积(Area under the curve,AUC)/MAP来评估大鼠勃起功能。最后,收集标本进行后续检测。结果:在脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA),核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)和蛋白质水平进行转基因鉴定的结果显示只有TGR中含有和表达hKLK1基因,其他野生型大鼠均不表达该基因。各组大鼠初始体重和初始Hcy水平无明显差异,但和Control组相比,其余3组最终体重均有所降低;而且Hcy结果显示和Control组相比,其余3组大鼠Hcy水平均明显升高,并且7%Met组和TGR+7%Met组的Hcy水平明显高于4%Met组,而7%Met组和TGR+7%Met组之间不存在统计学差异。不同电压参数下电刺激大鼠海绵体神经诱导阴茎勃起评估大鼠勃起功能结果显示:和Control组相比,其余3组大鼠ICP峰值/MAP和AUC/MAP比值均明显降低,并且7%Met组大鼠还要低于4%Met组,而TGR+7%Met组比值则明显高于7%Met组。结论:只有TGR中存在和表达hKLK1。通过高Met饮食成功建立HHcy大鼠模型,并且HHcy导致大鼠体重降低。HHcy可以引起大鼠ED,而TGR中的hKLK1表达可以明显改善HHcy大鼠勃起功能。第二部分hKLK1对高同型半胱氨酸血症大鼠阴茎海绵体内皮细胞和神经功能的影响目的:研究hKLK1对HHcy大鼠阴茎海绵体血管内皮细胞和神经功能的影响方法:使用不同电压参数电刺激大鼠海绵体神经评估勃起功能后,将收集到的部分大鼠阴茎组织标本冻存,然后从冻存组织中提取蛋白,检测各组大鼠阴茎组织中NADPH氧化酶亚基p22phox,p47phox和gp91phox的表达水平并比较其差异;检测各组大鼠阴茎组织中MDA和SOD的含量并比较其差异;检测各组大鼠阴茎组织中内皮细胞连接标志VE-cadherin,Occludin和Claudin-5的表达水平并比较其差异;检测Akt/e NOS途径的活性及二者的磷酸化水平以及NO和c GMP的浓度并比较其差异。同时,将另一部分收集到的大鼠阴茎组织标本切片进行免疫荧光染色,检测各组大鼠阴茎组织中PECAM-1、e NOS和n NOS的定位,表达水平并比较其差异。结果:和Control组大鼠相比,4%Met组和7%Met组中大鼠阴茎组织中p22phox,p47phox和gp91phox表达水平均明显升高;MDA含量明显升高而SOD含量降低;VE-cadherin,Occludin和Claudin-5表达水平明显降低;e NOS的表达水平,e NOS和Akt的磷酸化水平,n NOS的表达水平,PECAM-1的表达水平,NO浓度以及c GMP含量均明显降低。而且,这些指标在7%Met组相比4%Met组病理性变化更加剧烈,而TGR+7%Met组中由HHcy诱导的以上指标的病理性变化均得到明显改善,并且在SOD含量,Occludin表达水平和Akt的磷酸化水平和Control组无明显统计学差异。另外,Akt的表达水平在4组大鼠中无明显统计学差异。结论:HHcy可以通过诱导大鼠阴茎组织中氧化应激,血管内皮细胞连接功能降低,血管内皮细胞含量减少,Akt/e NOS/NO/c GMP信号通路活性降低损害大鼠阴茎勃起功能,而TGR中hKLK1基因的表达可以抑制以上病理变化来改善大鼠勃起功能。第三部分hKLK1对高同型半胱氨酸血症大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞的影响目的:通过体内和体外实验研究hKLK1对HHcy大鼠海绵体平滑肌的影响方法:使用不同电压参数电刺激大鼠海绵体神经评估勃起功能后,将收集到的部分大鼠阴茎组织标本冻存,然后从冻存的组织中提取蛋白,检测各组大鼠阴茎组织中α-SMA和TGF-β1表达水平,Collagen I和Collagen IV的表达水平,Rho A和ROCK1表达水平以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达水平并比较其差异。同时,将另一部分收集到的大鼠阴茎组织标本切片进行α-SMA免疫组化和免疫荧光,检测其表达水平并比较其差异;TUNEL检测大鼠阴茎组织中细胞凋亡水平。细胞实验方面:组织贴块法提取大鼠主动脉内皮细胞和阴茎海绵体平滑肌细胞原代并分别用标志蛋白PECAM-1和desmin进行鉴定,然后建立内皮细胞-平滑肌细胞共培养体系。观察生理状态下向共培养体系中加入人低分子量激肽原(LMWK)对海绵体平滑肌细胞中c GMP浓度的影响,以及共培养体系培养基中高Hcy浓度对海绵体平滑肌细胞中c GMP浓度,Rho A/ROCK信号通路活性,氧化应激水平以及凋亡水平的影响。结果:体内实验方面:和Control组大鼠相比,4%Met组和7%Met组中大鼠阴茎组织中α-SMA表达水平均明显降低;TGF-β1、Collagen I、Collagen IV、Rho A和ROCK1表达水平明显升高;Bax表达水平明显升高而Bcl-2表达水平均明显降低,且7%Met组中各指标变化较4%Met组更为明显。TGR+7%Met组中以上指标的病理性变化均得到明显改善。体外实验方面:PECAM-1和desmin的免疫荧光鉴定结果提示内皮细胞和平滑肌细胞纯度达到90%,原代细胞分离成功。共培养体系中加入LMWK后,WTR+LMWK组和TGR+LMWK组中c GMP浓度分别高于WTR组和TGR组。另外,和WTR+LMWK(5μM)组相比,WTR+LMWK(30μM)组和WTR+LMWK(100μM)组中c GMP浓度显著降低,Rho A和ROCK1表达水平明显升高,gp91phox表达水平和Bax/Bcl-2比值明显升高,且WTR+LMWK(100μM)组以上指标较WTR+LMWK(30μM)变化更加明显。而TGR+LMWK(100μM)组中这些病理指标均得到明显改善。结论:体内和体外实验证明HHcy可以通过诱导大鼠阴茎组织平滑肌功能障碍和细胞凋亡导致ED,而TGR中hKLK1基因的表达可以抑制以上病理变化来改善大鼠勃起功能。