糖广泛存在于生物体中,糖不仅是维持生命活动所需能量来源,它们在众多复杂生物过程中也发挥着不可替代的重要作用。透明质酸作为一种独特的糖胺聚糖,在化学结构上由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以重复二糖单位连接而成。不同于其它的糖胺聚糖,透明质酸没有分支结构,也没有硫酸化修饰。由于其独特的理化性质,透明质酸已经广泛应用在食品、医药、化妆品等领域。近年来,研究表明透明质酸在细胞识别和信号转导方面也发挥着极为重要的作用。例如,肿瘤细胞表面存在大量透明质酸特异性受体,透明质酸与受体结合后,能够通过内吞进入肿瘤细胞,这一发现为透明质酸靶向性抗肿瘤药物的研发奠定了基础。目前,商品化的透明质酸主要通过动物组织提取和微生物发酵两种方式获得。动物组织提取法受动物组织来源、透明质酸含量低等因素限制,同时,其制备工艺复杂、收率较低,容易残存其他种类糖胺聚糖,影响了透明质酸的质量,因此在医药及临床应用领域受到了一定的限制。细菌发酵法生产的透明质酸相比与动物组织提取法具有产率高、污染小等优势,但其也面临着细菌内毒素、蛋白质、核酸和重金属污染的风险。随着分子生物学研究的发展,透明质酸的体内合成途径得到了阐述。透明质酸合酶催化合成透明质酸的过程,需要消耗价格昂贵的糖核苷酸作为底物,限制了酶法合成透明质酸研究的发展。本论文研究旨在偶联糖核苷酸的酶法合成和透明质酸的酶法制备过程,建立单糖起始的透明质酸酶法合成技术体系,并进一步研究寡糖类纳米微球的制备工艺。论文第二章对E.coli来源的GlcNAc-1-P尿苷转移酶(tGlmU)进行分子改造研究。通过对tGhmU进行同源序列比对和蛋白结构分析,选取tGhmU中的关键保守氨基酸位点进行定点突变,研究这些保守氨基酸位点对催化反应底物选择性和催化活性的影响,以期获得催化活性提高或具有更广泛底物适应性的突变酶。酶学性质检测发现,构建的16个突变酶中,tGlmU Q76E、Q76P具有催化合成非天然糖核苷酸CDP-GlcNAc的活性,随后利用一锅法双酶法制备获得了稀有糖核苷酸CDP-GlcNAc;此外,突变酶tGlmU Y103F、N169R的催化合成UDP-GlcNAc的活性有了较大幅度的提高,拓宽了我们对糖核苷酸酶法合成的认识。论文第三章克隆表达了来源于Arabidopsisthaliana的葡萄醛酸激酶(GlcAK),GlcAK能够将GlcA磷酸化成GlcA-1-P,结合课题组已有的GlcA-1-P尿苷转移酶,可以实现UDP-GlcA的大量合成。GlcAK在原核表达系统中得到了可溶性表达,实现了 GlcA-1-P的制备,并通过活性炭纯化获得了高纯度的GlcA-1-P。在酶法合成UDP-GlcNAc和UDP-GlcA的基础上,论文第四章偶联了糖核苷酸的酶法合成和透明质酸的酶酶法,发展了一个以单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的技术体系,利用单糖作为起始底物,通过对酶反应过程中酶浓度比例、反应顺序等条件的优化,实现了以单糖作为起始底物的透明质酸的酶法合成。该方法避免了价格昂贵的糖核苷酸的消耗,以单糖为原料,建立了经济、高效的透明质酸的酶法合成技术。此外,我们进一步探索了糖类纳米微球的制备技术。利用透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠等多糖为原料,基于多糖表面丰富的荷电性,使用离子交联法制备多糖纳米微球,并对制备的纳米微球进行表征。在完善多糖类纳米微球制备工艺的基础上,进一步探索多糖纳米微球在环境治理、消毒灭菌、污水处理等领域的应用。