背景和目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人中最常见的神经退行性疾病,以进行性记忆下降和认知功能减退为主要临床表现。AD的发病机制复杂,尚未完全阐明。脑实质和脑血管壁的β-淀粉样肽(Amyloid-beta,Aβ)沉积是AD的主要病理特点。根据Aβ级联假说,AD是脑内Aβ的过度产生或清除障碍,Aβ在脑内过度集聚和沉积后通过诱发炎症、tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、神经变性和死亡而导致痴呆。Aβ是由其前体蛋白(Amyloid-betaβrecussorβrotein, AβPP)经酶切产生。AβPP主要表达于脑神经元,但是,全身其它多种组织也同样表达AβPP且可生成Aβ,比如血液、皮肤、骨骼肌等。而且,外周Aβ可跨过血脑屏障进入脑组织。目前认为脑内Aβ沉积来自脑组织自身产生的Aβ,而外周来源的Aβ对脑内β淀粉样变的影响并不清楚,值得研究。传统观点认为AD是大脑本身的疾病。周围系统疾病在AD发生发展中的作用尚不清楚。本课题对外周来源的Aβ和系统疾病在AD发生中的作用及机制进行初步探索,以从全身角度理解AD的发病机制。材料和方法研究一外周Aβ在阿尔茨海默病相关病理形成中的作用1.构建并联小鼠模型。本课题采用的雌性C57野生型小鼠(Wt小鼠)来自第三军医大学动物实验室,APPswe/PS1dE9转基因小鼠(Tg小鼠)来自美国Jackson实验室。并联的Wt小鼠和AD小鼠要求性别和年龄匹配。在并联手术前1月即9月龄时将Wt和AD小鼠配对并同龄饲养,使之相互适应,10月龄时做并联手术,分别并联至12月龄、14月龄、18月龄和22月龄,以未并联同龄Wt小鼠作为对照(每组n=6)。采取皮肤缝合的并联手术方法。2.取材。6%水合氯醛将小鼠麻醉后处死,右心房取血后,生理盐水灌注,取脑并称重。右侧半球置于4%多聚甲醛中固定,用作组织染色;左侧半球冻存于-80℃冰箱,用作生化分析。3. AD类型病理改变的组织染色。6E10、4G8、刚果红和硫磺素S染色检测Aβ斑块和脑淀粉样血管病(Cerebral amyloid agiopathy,CAA)。A11、6E10 分别与 DAPI 共染检测神经细胞内Aβ。pS396染色检测Tau磷酸化水平。6E10与CD45或者GFAP共染检测神经炎症。神经营养因子受体p75NTR和神经纤维NF200染色检测神经变性。普鲁士蓝染色检测脑微出血。4. ELISA检测。将脑组织加入RIPA裂解液裂解。10级强度超声处理40秒后,100,000×g4°C离心1小时,取上清液,为可溶性提取物。管底组织继续加入200μl70%FA液,10级强度超声处理30秒后,100,000×g4℃离心1小时,取上清液,为FA提取物。采用ELISA试剂盒检测小鼠外周血以及RIPA和FA提取物中的Aβ40和Aβ42水平。脑匀浆中炎症因子如TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的水平也用ELISA方法检测。5.免疫印迹。取适量脑粉加入RIPA裂解液溶解后超声处理,10,000g 4℃离心60分钟。BCA法测定总蛋白浓度。配制电泳胶做免疫印迹,一抗为抗Aβ、PSD93、PSD95、VAMP1、synaptophysin、pS199、pS396、LRP1 和 RAGE 抗体,二抗为抗 Actin 抗体。研究二常见病原体慢性感染与AD的相关性研究随机纳入2012年至2014年在大坪医院就诊的128例散发性AD患者,同时在本院健康体检中心随机抽取135例性别和年龄匹配的正常对照。采用酶联免疫方法定量检测人血液中抗巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV),单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type-1,HSV-1),肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae,C. pneumonia),幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori.以及伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi,B.burgdorferi)的IgG型抗体水平,确定机体感染情况。以同一患者血清中常见病原体抗体阳性数的总和作为感染负荷(Infectiousburden, IB)。检测血清Aβ40、Aβ42、TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的水平。分析感染负荷和AD的相关性,以及具有不同感染负荷的AD患者的血清Aβ和炎症因子水平差异。研究三阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与血液AD生物标志物的相关性研究随机纳入自2014年9月至12月在大坪医院睡眠中心就诊的94例可疑阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(Obstructive sleep aβnea syndrome, OSAS)患者。其中45例最终确诊为OSAS,剩下的49例单纯鼾症患者作为对照。纳入本研究的所有患者的MMSE评分均在正常范围内,表明其认知功能正常。检测血清Aβ40、Aβ42、总tau (T-tau)和磷酸化tau 181(P-tau 181)水平。分析Aβ和呼吸暂停低通气指数(Apnea hypopnea index,AHI)、血氧饱和度下降指数(3% oxygen desaturation index, ODI)、最低血氧饱和度值(Lowest Sa02)和平均血氧饱和度值(Mean Sa02)的相关性。研究四慢性阻塞性肺疾病与血液AD生物标志物的相关性研究随机纳入2014年至2015年在大坪医院呼吸科就诊的77例散发性慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者,同时随机抽取 45 例性别和年龄匹配的正常对照。纳入本研究的所有COPD患者的MMSE评分均在正常范围内,表明其认知功能正常。检测血清Aβ40、Aβ42、IL-6、降钙素原(procalcitonin, PCT)和C-反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)水平。分析Aβ水平与炎症和肺功能的相关性。结果研究一外周Aβ在阿尔茨海默病相关病理形成中的作用1.并联Wt小鼠的脑Aβ含量随并联时间延长而增加。12月龄、14月龄、18月龄以及22月龄并联Wt小鼠的外周血Aβ水平显著增高,与并联Tg小鼠外周血Aβ水平无显著性差异,表明Tg小鼠外周血Aβ进入并联Wt小鼠的血液循环系统,证明该并联模型构建成功。免疫印迹和ELISA方法检测不同并联月龄Wt小鼠脑组织Aβ发现,并联后脑Aβ水平随并联时间延长而逐渐增高。2.并联Wt小鼠脑内出现Aβ斑块和CAA。并联2月、4月和8月Wt小鼠脑内无明显Aβ沉积,但是,不同染色方法均观察到Aβ沉积于并联12月Wt小鼠的血管壁形成脑淀粉样血管病(Cerebral amyloid agiopathy,CAA),还可观察到外周Aβ沉积于脑实质形成小的Aβ斑块。另外,免疫组化染色还在并联12月Wt小鼠的皮层部分区域观察到胞浆染色阳性的神经细胞,表明外周血Aβ不仅沉积于脑血管壁及附近脑实质,而且可进入神经细胞并积聚。3.并联Wt小鼠脑内出现的其它AD类型改变。并联Wt小鼠脑内pS199和pS396水平增加,表明tau磷酸化加重。既往研究发现Aβ可诱导变性p75NTR神经纤维。在对照组Wt小鼠脑内未见变性p75NTR神经纤维,而在并联12月Wt小鼠皮层则观察到明显的变性p75NTR神经纤维。NF200也是一种神经损伤标记物。对照组Wt小鼠皮层可见致密、较长的NF200阳性神经纤维,而并联12月Wt小鼠皮层的NF200阳性神经纤维较稀疏,且NF200在胞浆大量积聚。为了研究并联是否加剧Wt小鼠脑内神经炎症反应,我们检测了并联Wt小鼠和对照Wt小鼠脑匀浆中几种常见炎症因子水平,发现并联12月Wt小鼠脑内TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平均明显升高。而且,并联Wt小鼠脑内CAA和Aβ斑块周围聚集大量活化的小胶质细胞和星形胶质细胞,进一步表明外周血Aβ进入脑内沉积后加剧神经炎症。另外,与对照组Wt小鼠相比,并联12月Wt小鼠脑微出血明显严重,血脑屏障上的Aβ转运体LRP1水平降低,而RAGE水平显著增高。研究二常见病原体慢性感染与AD的相关性研究与对照组相比,AD组中血清病原体抗体阳性数高的人群比例较高。校正各种危险因素后,AD组总感染负荷、细菌负荷和病毒负荷均明显高于对照组,且感染负荷越高,患AD的相对危险度越高,表明感染负荷是AD的独立危险因素。而且,感染负荷越高,血液中Aβ和炎症因子水平越高。研究三阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与血液AD生物标志物的相关性研究OSAS患者血清Aβ和P-tau181水平显著高于正常对照组。校正年龄、性别、受教育水平、吸烟史、体重指数等后,血清Aβ与衡量疾病严重程度的指标AHI呈正相关,与缺氧指标如MSa02和ODI也显著相关。研究四慢性阻塞性肺疾病与血液AD生物标志物的相关性研究COPD患者血清Aβ水平显著高于正常对照组。血清CRP、IL-6和PCT水平超过正常值的COPD患者的血清Aβ水平更高。而且,COPD患者的血清Aβ水平与疾病严重程度相关,肺功能越差,血清Aβ水平越高。讨论研究一外周Aβ在阿尔茨海默病相关病理形成中的作用无论是6E10、4G8、刚过红还是硫磺素S染色,均在并联12月Wt小鼠皮层血管壁观察到CAA,而且还在脑实质观察到小的Aβ斑块。另外,在并联12月Wt小鼠脑内观察到明显的tau异常磷酸化、神经变性、神经炎症和微出血,表明外周血Aβ进入Wt小鼠脑内并形成典型的AD类型病理改变。由于以Aβ为AD治疗靶点的临床试验未成功,Aβ级联假说目前受到质疑。AD模式动物由于过表达人AβPP基因而产生大量Aβ,导致神经元丢失和认知减退。但是,对于占AD人群绝大多数的散发性AD患者,其AβPP基因的表达水平与正常人并无差异,脑内Aβ过度积聚的主要原因是Aβ清除能力下降。本研究中,不表达人AβPP基因的小鼠暴露于外源性Aβ 12月后,脑内即出现典型AD类型病理改变,该结果进一步证实了 Aβ级联假说,表明Aβ是AD的核心致病物质。AβPP表达于中枢和外周组织,经蛋白酶切后生成Aβ。血液Aβ的来源包括脑和外周组织器官。血小板表达AβPP,被认为是Aβ的最大外周来源,而且MCI和AD患者的血小板膜上BACE1活性较正常人分别增加约24%和17%。早期研究发现,AD患者的皮肤成纤维细胞较正常人可分泌更多Aβ。AD患者的颞肌中Aβ水平也较正常人高。流行病学调查发现骨质疏松症患者的AD罹患风险较高。另有研究表明骨细胞可产生Aβ,且其在骨质疏松组织中的含量更高。因此,AβPP代谢紊乱可能是AD患者的一个全身性问题。但是,外周产生的Aβ能否进入脑内并沉积仍不清楚。本研究首次发现外周Aβ可进入Wt小鼠脑内诱导出AD类型病理改变。而且,Wt小鼠至少与AD小鼠并联12月后才会形成AD类型病理改变。因此,Wt小鼠诱导出AD类型病理改变的两个关键条件是获得人源性Aβ且时间足够长,我们推测这可能与散发型AD需要数十年的发病过程有关。目前研究者普遍认为脑内Aβ是AD发生的关键原因,而外周循环中的Aβ对脑AD类型病理改变的影响还不清楚。Wt小鼠通过与AD小鼠并联获得的外源性Aβ可沉积于脑血管壁、脑实质以及神经细胞,提示外周细胞产生的Aβ可能参与脑淀粉样变,AD很可能是一个全身系统性疾病。研究二常见病原体慢性感染与AD的相关性研究本研究发现感染负荷与AD相关,但是机制不明。这种相关性可能归结于AD患者更易感染病原体。但有研究表明,接种病原体疫苗可一定程度上预防AD发生。所以,这种相关性也可能是慢性感染促进了AD发生。另外,感染负荷可促进心脑血管疾病发生,而这些疾病是AD的危险因素。所以,感染负荷也可能通过增加心脑血管疾病风险而间接促进AD发生发展。本项研究中,感染负荷高的人群的外周血炎症因子水平较高,表明感染可能通过炎症途径增加AD罹患风险。AD患者体内存在大量针对Aβ的自身抗体,所以AD也被认为是一种自身免疫性疾病。但是,这些自身抗体的来源并不清楚。蛋白序列比对发现,多种病原体表达与人AβPP和Aβ相似的氨基酸序列。因此,感染也可能通过激活自身免疫系统产生大量自身抗体,对脑内神经元形成免疫攻击。感染负荷越高的人群的外周血Aβ水平越高,这是本研究的一项重要发现,它有助于我们理解感染负荷和AD的相关性,感染负荷可能通过增加Aβ水平促进AD发生。本研究证实常见病原体感染与Aβ代谢和AD患病风险相关,为AD的感染和炎症学说提供重要依据,也从另一方面说明AD是全身系统性疾病。研究三阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与血液AD生物标志物的相关性研究Aβ水平在中枢和外周是一个动态平衡,血清高Aβ水平可能代表脑内高Aβ负荷,因此,本研究与既往关于缺氧增加脑内Aβ的研究结论一致。另一方面,血清中升高的Aβ也可能来自外周表达AβPP和β-分泌梅的器官和组织。血清中磷酸化tau蛋白可作为反映神经损伤的生化标志物。本研究中,OSAS患者血清磷酸化tau蛋白水平显著升高,且与Aβ水平成正相关。因此,本研究观察到的OSAS患者血清磷酸化tau蛋白升高应该是缺氧所致。这是一个横断面研究,因此我们无法确定OSAS和Aβ的因果关系。近期研究发现持续性正压通气治疗可降低OSAS患者认知功能减退速度,而这可能得益于对缺氧的改善。但是,纠正缺氧是否能降低Aβ和磷酸化tau蛋白水平值得继续研究。总的来说,本研究发现OSAS患者血清Aβ升高,且与缺氧严重程度成正相关。该研究结果表明OSAS可能促进AD相关病理改变,提示AD是全身系统性疾病。OSAS是中老年人中的常见病,及时治疗该病或许能够在一定能够程度上预防AD的发生发展。研究四慢性阻塞性肺疾病与血液AD生物标志物的相关性研究此研究表明COPD促进AD相关病理生理过程发展。众所周知,呼吸道感染和炎症反应是COPD的重要特征。炎症在AD发病中起到重要作用。血清PCT水平是COPD伴有细菌感染的重要标志物。本研究发现血清PCT水平高的COPD患者的Aβ水平较高,表明感染和炎症可增加COPD患者Aβ水平。本研究中,COPD较严重即肺功能较好的COPD患者的血清Aβ水平较高,也说明缺氧可能是COPD患者血清Aβ水平增高的原因之一。本研究发现认知功能正常的COPD患者血清Aβ升高,或表明其已发生AD相关病理改变。该研究结果与目前COPD增加AD患病风险的流行病学调查一致。但是,这是一项横断面研究,期待未来纵向研究确定COPD患者血清Aβ升高在预测其AD患病风险中的作用。如果该假设得到验证,对COPD患者进行早期干预将有助于预防AD发生。结论Wt小鼠通过与AD小鼠并联获得的外源性Aβ可进入脑内形成CAA和Aβ斑块,表明外周Aβ可参与脑淀粉样变,提示AD很可能是一个全身系统性疾病。感染、OSAS、COPD与血液AD生物标志物具有相关性,进一步说明全身疾病可能影响Aβ代谢和AD发生。我们的研究结果有助于从全身角度理解AD的发病机制以及建立有效防治方法。