论文部分内容阅读
配伍是传统中药减毒方法之一,中药复方作为中医临床用药的常用形式,其配伍规律一直是人们研究的热点,但由于它的复杂性使其并没有很大的突破,而药对作为中药复方组成的核心,体现了经典复方的疗效,使系列复方具备共同点。因此,研究药对配伍规律可作为研究复方配伍规律的重要切入点之一,从而揭示其配伍规律及科学内涵,深入挖掘和提高中药复方的配伍理论,为复方的配伍机制研究提供线索和依据。同时,为以药对为基础的中药新药开发提供研究思路。因此,本文将从对药对配伍的机制进行考察,为今后药对配伍规律的深入研究提供借鉴,选用黄芪、附子及其配伍研究附子生物碱的吸收特性及吸收机制,以及对Caco-2细胞和正常大鼠的3种药物外排转运蛋白（Mrp2、P-gp、Bcrp）和3种紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、Zo-1）的影响变化。1.MTT法检测黄芪、附子及其配伍对Caco-2细胞毒性的影响研究选用Caco-2细胞模型,分别用MTT法筛选有效浓度剂量,完全培养基条件下,细胞作用24小时时附子安全有效浓度为25.41μg·mL-1;在HBSS培养条件下,细胞作用2小时时附子浓度在199.231195.36μg·mL-1范围内均为安全浓度。黄芪、附子配伍后明显增大了细胞存活率,且作用细胞24小时时解毒效果最佳。2.运用Caco-2细胞Transwell跨膜转运模型考察黄芪对附子吸收的影响以及附子6种生物碱吸收机制的研究黄芪-附子配伍对附子6种生物碱在Caco-2细胞模型的吸收影响结果表明,299.33、598.66、1197.32μg·mL-1的黄芪提取物对附子生物碱的Papp均有不同程度的抑制作用。附子吸收机理结果显示,附子6种生物碱的吸收很有可能存在主动转运过程,采用MATLAB拟合软件进行统计分析,通过比较发现,在细胞水平上附子6种生物碱的吸收转运包括简单扩散的被动转运过程和载体媒介转运过程,且Mrp2、P-gp、Bcrp三种外排转运蛋白均参与其主动转运过程。3.Western blot法和qRT-PCR法研究黄芪、附子及其配伍对Caco-2细胞3种外排转运蛋白和3种紧密连接蛋白的影响变化Western blot结果表明,与正常组比较,黄芪对药物转运蛋白（Mrp2、P-gp、Bcrp）及紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、Zo-1）的表达有不同程度的提高,其中黄芪低、中、高剂量对P-gp和Mrp2以及黄芪高剂量下对Bcrp的表达具有显著性差异（P<0.05）;与正常组比较,附子能显著下调Mrp2的表达、显著上调Bcrp的表达、对P-gp的表达无统计学差异;黄芪-附子配伍后,与正常组比较,3种蛋白的表达均有所上调,3个配伍比例对Mrp2蛋白表达有上调作用但无统计学差异,配伍比例为1:1与1:2时对P-gp和Bcrp蛋白表达有统计学差异。与正常组比较,Claudin-1、Occludin蛋白的表达量随着黄芪浓度的增大而显著增大（P<0.05）,黄芪在低、中剂量下能显著上调Zo-1蛋白表达,而在高剂量下表达量显著下降（P<0.05）;与正常组比较,附子显著增加Zo-1和Claudin-1蛋白表达量（P<0.05）,而对Occludin蛋白的表达无差异性;与正常组比较,黄芪-附子配伍对Zo-1和Claudin-1蛋白表达量有上调作用,在配伍比例为1:1和1:2时具有显著性(P<0.05,而Occludin蛋白表达量在这两个比例下显著下降（P<0.05）,在比例1:1/2时显著增大（P<0.05）。由此我们可以推断,黄芪、附子配伍有减附子毒的作用,3种外排蛋白参与了附子6种生物碱了转运过程,且黄芪可以通过调控外排蛋白（Mrp2、P-gp、Bcrp）和紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、Zo-1）的表达,减少对附子成分的吸收,这提示黄芪、附子可通过调节这些转运蛋白和紧密连接蛋白的表达而影响联合用药的转运,为其他临床用药提供了新方向和新指导。4.Western blot法、qRT-PCR法研究黄芪、附子及其配伍对正常大鼠3种外排转运蛋白和3种紧密连接蛋白表达的影响运用体内外模型相互佐证黄芪可以通过调控3种外排转运蛋白和3种紧密连接蛋白表达抑制附子的吸收,因此对48只正常大鼠灌胃给药饲养,Western blot法和qRT-PCR法结果与细胞实验结果基本一致。5.免疫荧光实验研究黄芪、附子及其配伍对正常及脾虚大鼠3种紧密连接蛋白表达、位置及形态变化的影响免疫荧光实验结果佐证了黄芪可以通过调控3种紧密连接蛋白的表达影响物质的吸收,也提出了黄芪可能通过调节紧密连接缝隙和/或促进杯状细胞的分泌抑制有害物质的吸收。6.Western blot法、qRT-PCR法研究黄芪、附子及其配伍对脾虚大鼠3种外排转运蛋白和3种紧密连接蛋白表达的影响考察黄芪、附子对3种外排蛋白和3种紧密连接蛋白表达和转录的影响在机体不同机能状态下是否有差异,结果表明,大鼠在脾虚状态下,生理功能发生紊乱,黄芪、附子及其配伍对机体内外排蛋白和紧密连接蛋白的表达和转录均发生了改变,且这几种蛋白的翻译及转录水平也不完全一致。