背景及目的:子宫内膜癌是女性生殖道三大恶性肿瘤之一,发病率仅次于宫颈癌,部分国家已经超过宫颈癌,成为女性生殖道恶性肿瘤发病率最高的疾病,使女性健康受到严重威胁。目前子宫内膜癌的诊断及治疗方法较以往有很大程度提高,然而在发展中国家其死亡率仍然较高,且病死率有上升趋势。目前子宫内膜癌的主要治疗方法为手术治疗,虽然现在手术方式及技术水平有很大提高,但很多患者术后仍存在复发、局部或远处转移的风险,并且预后较差,如果是晚期或复发转移患者五年生存率不足30%。然而临床上有很多患者就诊时已属于晚期,对于晚期内膜癌及复发转移的患者,放疗和(或)化疗常常是主要的治疗手段,但放疗和(或)化疗副作用较大,增加患者痛苦,降低患者生存质量,因此从分子生物学的角度研究影响子宫内膜癌的发生、发展机制的因素已成为学者们研究的重点,以期为子宫内膜癌的诊断、治疗及判断预后提供有价值信息。随着研究的不断深入,学者们认识到肿瘤微环境在肿瘤的发生及进展过程中意义重大,已成为研究的热点。肿瘤微环境包括肿瘤间质细胞和细胞外基质,是肿瘤细胞周围的生存环境,其中肿瘤间质包括:肿瘤相关巨噬细胞、内皮细胞、基质细胞、细胞因子、白细胞、成纤维细胞、血管等,肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)所占比例最大,是肿瘤间质细胞中最重要的细胞成分,对肿瘤微环境的影响意义重大。TAMs主要分为两型:M1型和M2型,M1型为经典活化型,抗原提呈功能强,能够激活机体抗肿瘤免疫功能,具有抗肿瘤活性;M2型为替代活化型,抗原提呈能力弱,能够抑制炎症反应,抑制免疫反应,从而促进肿瘤生长。TAMs具有与M2型巨噬细胞相似的表型特征和功能特点,其数量异常将导致严重的免疫抑制。TAMs与多种肿瘤的发生、发展及不良预后有关,因此我们推测在子宫内膜癌组织中也存在TAMs数量异常的可能,所以研究其在子宫内膜癌组织中的分布特点,有助于深入了解子宫内膜癌的发生机制。PTEN(phosphatase and tensin homolog)是一种重要的抑癌基因,全称为磷酸酶和张力蛋白同源物,已受到众多学者的关注,与细胞生长、增殖、凋亡及黏附等多种细胞生物学相关。PTEN基因被学者们称为子宫内膜癌的看家基因,因为据研究它与子宫内膜癌关系最密切,在子宫内膜癌中突变率最高。PTEN基因1997年被发现,位于人类染色体的10q23.3,由9个外显子,8个内含子所组成,长度约为200KB,是第十号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因。PTEN基因异常表达与肿瘤的发生、发展及侵袭关系密切,有研究表明,在前列腺癌中PTEN基因表达的缺失与TAMs浸润增加相关。然而PTEN与TAMs在子宫内膜癌中的关系如何还不清楚,因此本研究试图通过组织学及细胞学角度初步探讨二者之间的关系。目前研究发现多种信号通路参与子宫内膜癌的发生及发展过程中,其中PI3K/AKT/mTOR信号通路与子宫内膜癌关系密切。PI3K被激活后,与细胞内AKT的PH结构域结合,进而AKT被激活,然后从细胞膜向细胞质和细胞核转移,继而磷酸化调控下游mTOR。mTOR是调节细胞存活、生长及繁殖等的汇合点,细胞由G0/G1期进入S期及启动翻译信号必需mTOR,因此它能够调节细胞合成代谢及细胞有丝分裂。该信号通路是将细胞外信号传递到细胞核最重要的信号通路之一,在细胞新陈代谢、细胞生存、细胞周期调控、细胞增殖及凋亡、微血管生成等方面发挥极其重要作用。肿瘤的发生发展是由肿瘤细胞本身及其与周围微环境共同作用下的产物,TAMs作为肿瘤间质中最重要的组成部分是通过何种机制起作用的?是否与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关?目前还没有研究,因此本研究拟通过细胞学实验初步探讨TAMs与PI3K/AKT/mTOR信号通路的关系,以期对内膜癌机制的研究提供有价值信息。研究方法:应用免疫组化法检测35例子宫内膜癌组织标本中不同部位和临近正常组织中CD163+巨噬细胞密度及分布特点,分析其与临床病理参数、MVD及VEGF之间的关系。应用免疫组织化学方法检测子宫内膜癌组织中CD163标记的TAMs密度和PTEN表达,并分析其临床意义。依次使用PMA(48h)和IL-4(24h)作用人THP-1单核细胞72小时后,用流式细胞仪分析诱导后THP-1细胞中CD163标记物表达情况。用子宫内膜癌RL95-2细胞与PTEN过表达质粒共培养,建立PTEN过表达子宫内膜癌细胞系。体外将TAMs细胞分别与子宫内膜癌细胞和PTEN过表达子宫内膜癌细胞共培养,应用CCK-8实验、侵袭实验和迁移实验评估TAMs和PTEN对子宫内膜癌细胞增殖和侵袭能力的影响。将诱导后的TAMs与子宫内膜癌细胞(RL95-2)、PTEN过表达内膜癌细胞、PTEN过表达阴性对照内膜癌细胞及分别加入PI3K抑制剂(LY294002)、m TOR抑制剂(Rapamycin)的内膜癌细胞进行非接触共培养,应用CCK-8、增殖实验、侵袭实验、凋亡实验检测TAMs对子宫内膜癌细胞生物学习性的影响。将诱导后的TAMs与子宫内膜癌细胞(RL95-2)、PTEN过表达子宫内膜癌细胞、PTEN过表达阴性对照内膜癌细胞及分别加入PI3K抑制剂(LY294002)、mTOR抑制剂(Rapamycin)的内膜癌细胞进行非接触共培养,应用Western blot及RT-PCR检测共培养体系中子宫内膜癌细胞(Rl95-2)、PTEN及PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白及其mRNA表达情况。结果:1.肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)多分布于癌巢、肿瘤间质及向肌层浸润的边缘,其密度大于正常子宫内膜组织(P<0.01)。2.TAMs密度与子宫内膜癌临床病理参数的相关性分析发现:子宫内膜癌边缘TAMs密度与子宫内膜癌FIGO分期、组织学分级、肌层浸润及淋巴结转移相关(P<0.05)。内膜癌间质TAMs密度与组织学分级、肌层浸润及淋巴结转移相关。癌巢内TAMs密度与FIGO分期、组织学分级、肌层浸润、淋巴结转移、年龄、体重指数、绝经与否及肿瘤大小无相关性(P﹥0.05),内膜癌边缘TAMs密度与子宫内膜癌患者年龄、体重指数、绝经与否及肿瘤大小无相关性(P﹥0.05)。3.对TAMs密度和VEGF之间的相关性分析发现:癌间质及肿瘤浸润性边缘TAMs密度与VEGF存在显著正相关性(P<0.05)。4.对TAMs密度与MVD之间的Pearson相关分析发现:癌间质及肿瘤浸润性边缘TAMs密度与MVD之间存在正相关(Pearson相关系数分别为0.57和0.51,P值分别为0.018和0.011)。癌巢内TAMs密度与MVD之间无明显相关性(Pearson相关系数为0.17,P=0.353)。5.子宫内膜癌间质中CD163+细胞密度与PTEN蛋白表达之间存在显著相关性(P<0.05)。CD163+细胞密度增加与PTEN蛋白表达缺失相关。6.流式细胞仪分析诱导后THP-1细胞中CD163标记物表达明显增加,即THP-1细胞被成功诱导为肿瘤相关巨噬细胞。7.子宫内膜癌RL95-2细胞与PTEN过表达质粒共培养后,用Real-time PCR和Western blot可检测出高水平的PTENmRNA和蛋白质,成功建立稳定PTEN过表达RL95-2细胞系。CCK-8实验、侵袭实验、迁移实验结果显示:TAMs能够促进RL95-2内膜癌细胞的增殖、侵袭、迁移,PTEN过表达能够抑制TAMs诱导的RL95-2内膜癌细胞的增殖、侵袭、迁移。8.CCK-8实验、侵袭实验、迁移实验、凋亡实验结果显示:TAMs能够促进RL95-2内膜癌细胞的增殖、侵袭、迁移,抑制RL95-2内膜癌细胞凋亡,PTEN过表达、PI3K抑制剂(LY294002)、mTOR抑制剂(Rapamycin)能够抑制TAMs诱导的RL95-2内膜癌细胞的增殖、侵袭、迁移,促进RL95-2内膜癌细胞凋亡。9.Western blot实验结果表明内膜癌RL95-2细胞与TAMs共培养后p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白含量明显增高,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。PTEN过表达组、PI3K抑制剂(LY294002)组、mTOR抑制剂(Rapamycin)组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白含量均降低,差异有显著性(P<0.01)。Real-time PCR发现各组PI3K、AKT及mTORmRNA水平无明显差异。结论:1.子宫内膜癌组织中不同部位TAMs密度与患者临床病理参数之间关系不同,肿瘤间质及肿瘤浸润性边缘部位TAMs密度更高,并与VEGF及MVD密切相关。2.TAMs细胞密度增加与PTEN蛋白表达缺失相关。TAMs能够促进内膜癌细胞的增殖、侵袭、迁移,PTEN过表达能够抑制TAMs诱导的RL95-2内膜癌细胞的增殖、侵袭、迁移。3.TAMs通过降低PTEN含量激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,从而促进内膜癌进展。PTEN过表达、PI3K抑制剂(LY294002)、m TOR抑制剂(Rapamycin)通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,从而抑制TAMs的促进内膜癌进展作用。