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急性胰腺炎（Acute Pancreatitis，AP）是临床常见的急腹症之一，发病急骤，发展迅猛。AP若未能及时得到妥善干预，可发展为重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis，SAP），并发全身炎症反应综合征（SIRS）和多脏器功能障碍综合征（MODS），死亡率高达10%～30%。而急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是SAP最常见的一种早期并发症，也是早期高死亡率的主要原因，入院7日内死亡的SAP病人有60%~70%主要死于呼吸功能衰竭。近年来，国内外学者把这种由急性胰腺炎所导致的肺部损害称之为急性胰腺炎相关性肺损伤（APALI）。尽管有关APALI发病机制及药物干预的研究越来越多，但由于APALI病理变化极其复杂，其临床治疗一直处于多学科交叉探索之中。早期积极手术治疗不仅不能缓解病情，常因手术应激、创伤等加剧病情变化，目前临床仍以激素、机械通气及对症治疗为主，但效果不甚理想，死亡率仍高居不下。
本课题组20余年致力于APALI的发病机制和中西医结合治疗的基础与临床研究，证实中西医结合治疗APALI具有明显效果，可以显著缩短病程，降低病死率。因此，将中医学的理论与现代医学知识及方法相结合，在SAP、APALI的救治方面将大有可为。中医学认为，急性胰腺炎属腑病的范畴。肠道屏障功能障碍是SAP引起急性肺损伤的病理基础，此与“肠病及肺”中医理论比较一致，故在治疗上也要“从肠治肺”。中医认为“六腑以通为用”，不通则痛。故疾病早期应予通里攻下之法，涤荡肠胃，推陈致新，驱邪外出，这是早期防治APALI的核心与关键。著名中西医结合学者姚树坤提出系统生物学是中西医结合的桥梁，认为物质是生物信息的载体，是生物功能基础。基于多组学联合策略探究中医病证的发病规律和中药及组分作用规律是系统生物学最基本的方法学。因此，本课题以胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠（Sodium Taurocholate,STC）诱导的APALI大鼠动物模型为研究对象，应用转录组学、蛋白组学、Western Blot、Real-time PCR、免疫组化等现代生物技术和方法，系统探究与APALI相关的基因与蛋白谱的表达规律，并应用大黄素（Emodin，EMO）进行干预性治疗的探索，以期阐明EMO治疗APALI的作用机理，充分挖掘EMO在治疗APALI过程中可能的信号通路及分子靶点，为进一步阐明APALI发病机制及应用中西医结合方法防治APALI提供新的思路和方法，为降低SAP的病死率奠定理论基础和实验依据。
第一部分：大黄素通过调控LncRNA-mRNA网络治疗急性胰腺炎肺损伤的实验研究
目的：观察lncRNA-mRNA网络在SAP诱导ALI中的作用及EMO、DEX的影响。
方法：经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠构建大鼠SAP模型，所有大鼠随机分为假手术组（Sham），对照组（CON），重症急性胰腺炎组（SAP），大黄素组（EMO），地塞米松组（DEX）。各组又分6h和24h亚组。HE染色评估胰腺、肺组织病理变化；免疫组化染色检测肺组织中ly6G+细胞；ELISA法检测血清淀粉酶、TNF-α、IL-6的变化；自动分析仪检测动脉血气分析；透射电镜观察肺泡上皮细胞超微结构变化；RNA-seq法检测各组基因表达谱；构建lncRNA-mRNA共表达网络；qRT-PCR验证lncRNAs和mRNAs的表达水平。
结果：与Sham组及CON组相比较，SAP组大鼠胰腺组织HE染色出现不同程度的水肿、坏死、出血、白细胞浸润，病理评分明显升高（p＜0.001），且24h组高于6h（p＜0.05）；肺组织HE染色可见不同程度肺泡壁增厚、出血、白细胞浸润，病理评分明显升高（p＜0.001），且24h组高于6h（p＜0.05）。与CON组相比较，SAP组大鼠血清AMY、TNF-α、IL-6均明显升高（p＜0.001），且24h高于6h（p＜0.01）。与CON组相比较，SAP_6h组大鼠的PaO2水平略有所下降（p＜0.01），PaCO2水平明显上升（p＜0.001），但仍处于可代偿阶段。而SAP_24h组实验大鼠的PaO2明显下降（p＜0.001），PaCO2水平均明显上升（p＜0.001），出现明显呼吸窘迫现象。与CON_24h组相比较，SAP_24h大鼠肺组织中Ly6G+细胞浸润明显增多（p＜0.001），透射电镜下显示大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞核形状不规则或固缩，板层小体明显减少，微绒毛广泛脱落、消失，基底膜明显囊泡化，紧密连接破坏。与SAP组相比较，EMO和DEX胰腺及肺组织病理评分明显下降（p＜0.001），血清中AMY、TNF-α、IL-6的表达水平明显降低（p＜0.001），Ly6G+细胞的浸润明显减少（p＜0.001），表明EMO和DEX可以明显减轻病理损伤，保护肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞的超微结构。RNA-seq结果显示，基因表达谱对时间点、样本特征（分组）均有明显依赖性。EMO和DEX均可以促进RNA水平向sham组水平恢复。其中，DEX下调表达的基因明显多于上调表达的基因，不同的是EMO上调表达的基因明显多于下调表达的基因。EMO和DEX对APALI肺组织基因表达谱有所不同，GO分析显示EMO和DEX均具有抑制免疫反应、调控细胞因子介导的信号通路。此外，DEX还具对抗LPS、抗氧化、促进细胞分化修复等作用，而DEX对其中部分模块基因起到与模型组一致的调控作用，提示可能具有不可忽视的负调节作用，两者具有不同的作用靶点和作用机制。EMO可能通过lncRNA（AABR07062477.2和Rn60_7_1164.1）及其共表达靶基因Nrp1、Tbx2-Cdkn-1a发挥免疫抑制和促进肺上皮细胞分化、修复、抗凋亡作用，减轻SAP诱导的肺组织损伤。
结论：1）EMO可以抑制TNF-α、IL-6的表达和释放，抑制PMN的浸润，保护肺泡Ⅱ型上皮细胞的结构，从而改善SAP大鼠呼吸功能，减轻SAP诱导的肺组织损伤。2）EMO和DEX对APALI肺组织基因表达谱的影响有所不同，EMO具有抑制过度炎性反应、对抗LPS、抗氧化等作用，两者具有不同的作用靶点和作用机制。3）EMO可能通过调控lncRNA（AABR07062477.2和Rn60_7_1164.1）及其共表达靶基因Nrp1、Tbx2-Cdkn-1a发挥免疫抑制和促进肺上皮细胞分化、修复、抗凋亡作用，减轻SAP诱导的肺组织损伤。
第二部分：基于蛋白组学研究大黄素治疗急性胰腺炎肺损伤的分子机制
目的：从蛋白水平探讨EMO治疗急性胰腺炎肺损伤的分子机制。
方法：5%牛磺胆酸钠经胆胰管逆行注射构建大鼠SAP模型，所有大鼠分为假手术（Sham）组，对照（CON）组，重症急性胰腺炎（SAP）组，大黄素（EMO）组，地塞米松（DEX）组。各组又分6h和24h亚组。应用LTQ-Orbitrap XL质谱分析各组大鼠肺组织蛋白水平的变化规律，以Western blot法验证重要靶点的表达，以期探讨EMO治疗APALI的作用靶点和可能的机制。
结果：本实验共鉴定了14973个肽段和2219种蛋白质。与CON_6h组相比较，SAP_6h组大鼠肺组织中分别有22种上调和20种下调蛋白质。与CON_24h组相比较，SAP_24h组大鼠肺组织中分别有25种上调和78种下调蛋白质。其中，EMO在6h时分别恢复3个SAP上调蛋白和6个SAP下调蛋白，在24h时分别恢复7个SAP上调蛋白和22个SAP下调蛋白。DEX在6h时分别恢复8个SAP上调蛋白和8个SAP下调蛋白，在24h时分别恢复10个SAP上调蛋白和32个SAP下调蛋白。Sftpa、Spy（6h均下调），Ckm（6h和24h均下调）、Serpin-b1（6h和24h均上调）和AQP5、Sftpb、Sec14l3（24h均下调）在APALI肺组织中表达的变化（p＜0.05），这些蛋白的变化在一定程度上证实了SAP可以诱导肺组织损伤。AQP5、Sftpb被EMO和DEX回调（p＜0.05），证实EMO和DEX可以减轻SAP诱导的肺组织损伤。GO分析显示，EMO回调的蛋白高度富集于内肽酶活性抑制和基底膜及胶原细胞外基质保护相关通路中。Western blot结果显示，Lamc2、Serpin-b1在APALI肺组织中表达升高（p＜0.05），而Serpin-a1恰好相反在APALI肺组织中表达降低（p＜0.05），EMO能明显回调Lamc2,Serpin-b1和Serpin-a1的表达（p＜0.05）。蛋白互作网络结果显示，EMO可能通过上调Serpin-a1的表达抑制中性粒细胞蛋白酶（NPs）活性，进而阻断PMN、NPs、Lamc2循环，缓解SAP诱导的肺组织损伤。
结论：1）Serpin-b1在APALI肺组织中表达升高，可能是反应APALI肺组织损伤严重程度的又一新标志物。2）PMN在APALI肺组织中高度浸润，释放大量NPs，促进Lamc2切割，Lamc2又可促进PMN粘附、迁移，三者可能形成一个恶性循环，在APALI的发生发展中发挥重要作用。3）EMO可能通过上调Serpin-a1的表达，抑制NPs活性，阻断PMN、Nps、Lamc2循环，减轻SAP诱导的肺组织损伤，有望应用于SAP及APALI的临床治疗。
本课题组20余年致力于APALI的发病机制和中西医结合治疗的基础与临床研究，证实中西医结合治疗APALI具有明显效果，可以显著缩短病程，降低病死率。因此，将中医学的理论与现代医学知识及方法相结合，在SAP、APALI的救治方面将大有可为。中医学认为，急性胰腺炎属腑病的范畴。肠道屏障功能障碍是SAP引起急性肺损伤的病理基础，此与“肠病及肺”中医理论比较一致，故在治疗上也要“从肠治肺”。中医认为“六腑以通为用”，不通则痛。故疾病早期应予通里攻下之法，涤荡肠胃，推陈致新，驱邪外出，这是早期防治APALI的核心与关键。著名中西医结合学者姚树坤提出系统生物学是中西医结合的桥梁，认为物质是生物信息的载体，是生物功能基础。基于多组学联合策略探究中医病证的发病规律和中药及组分作用规律是系统生物学最基本的方法学。因此，本课题以胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠（Sodium Taurocholate,STC）诱导的APALI大鼠动物模型为研究对象，应用转录组学、蛋白组学、Western Blot、Real-time PCR、免疫组化等现代生物技术和方法，系统探究与APALI相关的基因与蛋白谱的表达规律，并应用大黄素（Emodin，EMO）进行干预性治疗的探索，以期阐明EMO治疗APALI的作用机理，充分挖掘EMO在治疗APALI过程中可能的信号通路及分子靶点，为进一步阐明APALI发病机制及应用中西医结合方法防治APALI提供新的思路和方法，为降低SAP的病死率奠定理论基础和实验依据。
第一部分：大黄素通过调控LncRNA-mRNA网络治疗急性胰腺炎肺损伤的实验研究
目的：观察lncRNA-mRNA网络在SAP诱导ALI中的作用及EMO、DEX的影响。
方法：经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠构建大鼠SAP模型，所有大鼠随机分为假手术组（Sham），对照组（CON），重症急性胰腺炎组（SAP），大黄素组（EMO），地塞米松组（DEX）。各组又分6h和24h亚组。HE染色评估胰腺、肺组织病理变化；免疫组化染色检测肺组织中ly6G+细胞；ELISA法检测血清淀粉酶、TNF-α、IL-6的变化；自动分析仪检测动脉血气分析；透射电镜观察肺泡上皮细胞超微结构变化；RNA-seq法检测各组基因表达谱；构建lncRNA-mRNA共表达网络；qRT-PCR验证lncRNAs和mRNAs的表达水平。
结果：与Sham组及CON组相比较，SAP组大鼠胰腺组织HE染色出现不同程度的水肿、坏死、出血、白细胞浸润，病理评分明显升高（p＜0.001），且24h组高于6h（p＜0.05）；肺组织HE染色可见不同程度肺泡壁增厚、出血、白细胞浸润，病理评分明显升高（p＜0.001），且24h组高于6h（p＜0.05）。与CON组相比较，SAP组大鼠血清AMY、TNF-α、IL-6均明显升高（p＜0.001），且24h高于6h（p＜0.01）。与CON组相比较，SAP_6h组大鼠的PaO2水平略有所下降（p＜0.01），PaCO2水平明显上升（p＜0.001），但仍处于可代偿阶段。而SAP_24h组实验大鼠的PaO2明显下降（p＜0.001），PaCO2水平均明显上升（p＜0.001），出现明显呼吸窘迫现象。与CON_24h组相比较，SAP_24h大鼠肺组织中Ly6G+细胞浸润明显增多（p＜0.001），透射电镜下显示大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞核形状不规则或固缩，板层小体明显减少，微绒毛广泛脱落、消失，基底膜明显囊泡化，紧密连接破坏。与SAP组相比较，EMO和DEX胰腺及肺组织病理评分明显下降（p＜0.001），血清中AMY、TNF-α、IL-6的表达水平明显降低（p＜0.001），Ly6G+细胞的浸润明显减少（p＜0.001），表明EMO和DEX可以明显减轻病理损伤，保护肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞的超微结构。RNA-seq结果显示，基因表达谱对时间点、样本特征（分组）均有明显依赖性。EMO和DEX均可以促进RNA水平向sham组水平恢复。其中，DEX下调表达的基因明显多于上调表达的基因，不同的是EMO上调表达的基因明显多于下调表达的基因。EMO和DEX对APALI肺组织基因表达谱有所不同，GO分析显示EMO和DEX均具有抑制免疫反应、调控细胞因子介导的信号通路。此外，DEX还具对抗LPS、抗氧化、促进细胞分化修复等作用，而DEX对其中部分模块基因起到与模型组一致的调控作用，提示可能具有不可忽视的负调节作用，两者具有不同的作用靶点和作用机制。EMO可能通过lncRNA（AABR07062477.2和Rn60_7_1164.1）及其共表达靶基因Nrp1、Tbx2-Cdkn-1a发挥免疫抑制和促进肺上皮细胞分化、修复、抗凋亡作用，减轻SAP诱导的肺组织损伤。
结论：1）EMO可以抑制TNF-α、IL-6的表达和释放，抑制PMN的浸润，保护肺泡Ⅱ型上皮细胞的结构，从而改善SAP大鼠呼吸功能，减轻SAP诱导的肺组织损伤。2）EMO和DEX对APALI肺组织基因表达谱的影响有所不同，EMO具有抑制过度炎性反应、对抗LPS、抗氧化等作用，两者具有不同的作用靶点和作用机制。3）EMO可能通过调控lncRNA（AABR07062477.2和Rn60_7_1164.1）及其共表达靶基因Nrp1、Tbx2-Cdkn-1a发挥免疫抑制和促进肺上皮细胞分化、修复、抗凋亡作用，减轻SAP诱导的肺组织损伤。
第二部分：基于蛋白组学研究大黄素治疗急性胰腺炎肺损伤的分子机制
目的：从蛋白水平探讨EMO治疗急性胰腺炎肺损伤的分子机制。
方法：5%牛磺胆酸钠经胆胰管逆行注射构建大鼠SAP模型，所有大鼠分为假手术（Sham）组，对照（CON）组，重症急性胰腺炎（SAP）组，大黄素（EMO）组，地塞米松（DEX）组。各组又分6h和24h亚组。应用LTQ-Orbitrap XL质谱分析各组大鼠肺组织蛋白水平的变化规律，以Western blot法验证重要靶点的表达，以期探讨EMO治疗APALI的作用靶点和可能的机制。
结果：本实验共鉴定了14973个肽段和2219种蛋白质。与CON_6h组相比较，SAP_6h组大鼠肺组织中分别有22种上调和20种下调蛋白质。与CON_24h组相比较，SAP_24h组大鼠肺组织中分别有25种上调和78种下调蛋白质。其中，EMO在6h时分别恢复3个SAP上调蛋白和6个SAP下调蛋白，在24h时分别恢复7个SAP上调蛋白和22个SAP下调蛋白。DEX在6h时分别恢复8个SAP上调蛋白和8个SAP下调蛋白，在24h时分别恢复10个SAP上调蛋白和32个SAP下调蛋白。Sftpa、Spy（6h均下调），Ckm（6h和24h均下调）、Serpin-b1（6h和24h均上调）和AQP5、Sftpb、Sec14l3（24h均下调）在APALI肺组织中表达的变化（p＜0.05），这些蛋白的变化在一定程度上证实了SAP可以诱导肺组织损伤。AQP5、Sftpb被EMO和DEX回调（p＜0.05），证实EMO和DEX可以减轻SAP诱导的肺组织损伤。GO分析显示，EMO回调的蛋白高度富集于内肽酶活性抑制和基底膜及胶原细胞外基质保护相关通路中。Western blot结果显示，Lamc2、Serpin-b1在APALI肺组织中表达升高（p＜0.05），而Serpin-a1恰好相反在APALI肺组织中表达降低（p＜0.05），EMO能明显回调Lamc2,Serpin-b1和Serpin-a1的表达（p＜0.05）。蛋白互作网络结果显示，EMO可能通过上调Serpin-a1的表达抑制中性粒细胞蛋白酶（NPs）活性，进而阻断PMN、NPs、Lamc2循环，缓解SAP诱导的肺组织损伤。
结论：1）Serpin-b1在APALI肺组织中表达升高，可能是反应APALI肺组织损伤严重程度的又一新标志物。2）PMN在APALI肺组织中高度浸润，释放大量NPs，促进Lamc2切割，Lamc2又可促进PMN粘附、迁移，三者可能形成一个恶性循环，在APALI的发生发展中发挥重要作用。3）EMO可能通过上调Serpin-a1的表达，抑制NPs活性，阻断PMN、Nps、Lamc2循环，减轻SAP诱导的肺组织损伤，有望应用于SAP及APALI的临床治疗。