目的:通过制作大鼠背部皮肤深Ⅱ度烧伤模型,给予大鼠模型强饲L-精氨酸(L-arginine L-Arg),并在烧伤创面局部联合应用纤维连接蛋白(fibronectin FN),干预创面愈合过程,从而观察L-精氨酸与纤维连接蛋白联合应用对深Ⅱ度烧伤创面愈合速度和愈合质量的影响;并通过免疫组织化学方法揭示烧伤愈合过程中一氧化氮合酶(NOS)的表达规律;通过光镜观察愈合期间不同阶段的成纤维细胞数量及胶原纤维的含量变化;通过生物化学方法检测肉芽组织中羟脯氨酸含量;通过实验前后对比,观察创面的愈合状况。研究L-精氨酸与纤维连接蛋白对深Ⅱ度烧伤创面愈合的影响,为临床探索促进烧伤创面愈合的有效方法,并为进一步深化烧伤创面愈合修复的临床研究提供实验依据。方法:1、实验动物:雄性健康Wistar大鼠60只,称重,编号。2、实验动物分组:将大鼠随机分为4组:即对照组(0.9%生理盐水)、实验A组(L-Arg 400mg/kg/d联合0.5mg/ml的FN0.05ml)、B组(L-Arg 400mg/kg/d)、C组(0.5mg/ml的FN0.05ml)。每组15只。3、深Ⅱ度烧伤模型制备方法:大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉(35mg/kg),背部剪毛,8%硫化钠脱毛,温清水清洗,拭干。饲养24小时后用同法戊巴比妥腹腔注射麻醉成功后,将大鼠俯卧位固定于手术台上。在背部脊柱两侧旁开1cm,头尾两端平行于脊柱各标记一个边长为1.5cm,面积为2.25cm2的正方形预处理标记线。用相同面积的煤油纱布覆于背部的标记线内,用湿纱布保护周围皮肤后,点燃煤油纱布并使之燃烧10秒后用生理盐水纱布盖灭,形成4个正方形深Ⅱ度烧伤创面(病理证实,图3)。取0.5mg/ml的FN0.05ml注射于实验A组和C组每个创面筋膜层及创面皮下组织内,对照组和实验B组给予0.9%生理盐水辅料包扎。待大鼠清醒后,按照400mg/kg/d计算并分别给与实验A组和B组L-Arg灌胃。隔日换药一次(处死动物当天不换药)。实验A组和C组每天每个创面注射0.5mg/ml的FN0.05ml,直至动物处死。4、取材:每组动物分为5组,每组3只,分别在术后3、5、7、14、21天切取原烧伤范围内皮肤组织全层,随机将一块组织固定在4%多聚甲醛中,常规石蜡包埋,切片,分别行常规HE染色、Masson染色及免疫组化染色。剩余的组织于-20℃冷冻保存,行组织化学检测。5、观察指标:(1)大体观察。(2)成纤维细胞数密度(numerical density on area,NA):400倍光镜下观察HE染色切片,在肉芽组织中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取10个矩形视野(0.0052mm2/视野),目测计数并计算切片内单位面积成纤维细胞数量,结果取均数。(3)胶原纤维面密度(area density on area,AA):Masson染色组织切片,在肉芽组织中央浅部、中央深部、两侧部个随机选取5个视野,利用计算机辅助病理图像分析系统,计算绿染的胶原纤维的面密度,结果取均数。(4)按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书操作测定肉芽组织羟脯氨酸含量。(5)对免疫组化染色切片,光镜观察NOS2分布部位和着色深浅程度。采用数码医学图像分析系统,测阳性细胞比率。6、统计学处理:用SPSS12.0 for windows统计软件,采用单因素方差分析方法进行统计学处理,数据以±s表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、形态学观察:对照组于创伤后20~21天可以基本愈合;实验A组肉芽组织生长良好,愈合时间较对照组提前3~4天。实验B组、C组愈合情况良好,较对照组提前1~2天。2、光镜观察:实验A组在烧伤后3天,5天,7天比对照组和实验B组、C组均有较多的毛细血管形成,烧伤后14天,21天成纤维细胞,胶原纤维排列整齐;实验B组、C组在烧伤后3天,5天,7天虽也有较多的毛细血管形成,但是较实验A组少,且炎性反应较实验A组严重。3、成纤维细胞数密度(NA):实验A组、B组、C组在烧伤后3、5、7天NA均高于对照组水平(P<0.05),而在烧伤后14、21天均低于对照组(P<0.05);而实验A组较B、C组更为明显(P<0.01)。4、胶原纤维面密度(AA):四组均呈持续性增加的趋势,实验A组在所有时间点均高于对照组(P<0.01);B、C组在所有时间点亦高于对照组(P<0.05)。5、羟脯氨酸含量:对照组羟脯氨酸含量从创伤后第3天到第14天进行性增加;从第14天到第21天缓慢下降。实验A组在烧伤后各时间点羟脯氨酸含量均高于对照组(P<0.01);实验B、C组在烧伤后各时间点羟脯氨酸含量亦高于对照组(P<0.05)。6、NOS2阳性细胞比率:对照组烧伤后3天细胞阳性染色强度增强并达到高峰,3~7天细胞中的NOS2在细胞中的阳性表达相对维持稳定水平,烧伤后14天细胞中的阳性表达再次达到一个高峰,其后阳性表达逐渐减弱。而实验A、B、C三组烧伤后3天开始细胞阳性染色增强,到第14天时达到高峰,其中以A组阳性表达最强(A组P<0.01,B、C组P<0.05),其后阳性表达逐渐减弱。结论:在烧伤创面的愈合过程中单独使用L-精氨酸或纤维连接蛋白可以促进烧伤创面的愈合,而局部外用纤维连接蛋白的同时联合全身应用L-精氨酸则具有显著的促进烧伤创面修复的作用,可以明显加快大鼠背部皮肤深Ⅱ度烧伤创面的愈合时间。