我国是结核病高发国家,在全球,发病率仅次于印度。在国内,结核病发病率也始终处于前列。在所有结核病人中,约有10-15%是肺外结核,而肺外结核居首位的是骨与关节的结核。临床上,骨结核病人十分常见。骨结核最常用的治疗方法是外科清除骨结核病灶。结核病灶清除后,留有结核性骨缺损。目前,国内医疗市场尚无修复结核性骨缺损植入材料制式产品。在修复普通骨缺损方面,近年来,涌现出了很多的新材料,也有很多新工艺,并有企业生产的制式产品。但这些产品在修复结核性骨缺损方面,有许多不尽人意的地方,诸如:材料只有修复骨缺损作用而没有抗结核作用;结核性骨缺损比一般骨缺损恢复慢,材料吸收降解和成骨填充作用不能达到很好匹配等。在修复结核性骨缺损方面,还处于研究阶段,许多学者构建了许多新材料,但也不免有抗结核药物成分单一,药物释放不稳定,浓度过大影响成骨作用,浓度过小不能杀灭结核杆菌,而且造成机体耐药性增加。因此,我们设计了一种既具有充填骨缺损、重建和诱导成骨作用,又具有局部持续、立体缓慢释放抗结核药物的新型药物缓释骨修复支架材料,来解决临床上骨关节结核病灶清除术后的结核性骨缺损修复。本研究根据骨组织工程原理,将抗结核缓释微球负载于骨组织工程支架里,制成抗结核复合骨组织工程材料。骨组织工程支架以β-磷酸三钙做为基础材料,通过3D打印工艺制备成网格状结构。采用利福平和异烟肼分别制作成一定直径的聚乳酸-羟基乙酸共聚物抗结核药物微球。研制成既具有骨修复作用,又具有抗结核作用的功能性材料,并进行了部分体外、部分体内系列实验,以期为结核性骨缺损寻找到一种理想的具有抗结核药物局部释放,又具有骨组织修复功能的修复材料。一、3D打印β-磷酸三钙支架负载抗结核缓释药物复合材料的制备、特征和力学性能本实验复合材料采用3D打印方法制备,采用喷墨式工艺制成具有抗结核作用的功能性复合骨组织工程材料。通过环境扫描电镜观察显示该材料在支架区有微观多孔隙结构,微孔分布均匀,微观孔隙互相连通,大小相仿,孔径2~8μm。经检测,三维多孔β-磷酸三钙支架总孔隙率检测为(61.76±2.53)%,其中宏观孔隙率约为42.5%,微观孔隙率为19.26%。RFP/PLGA微球呈现暗红色;RFP/PLGA微球呈现白色。在RFP/PLGA微球和RFP/PLGA微球周围有未能包封药物的PLGA小微球存在。电子扫描显微镜观察见微球形态呈球形,表面布满规则的0.5μm~1.5μm大小的小孔,这些小孔是RFP和INH释放的通道。环境扫描电镜观察显示该材料在支架区有微观多孔隙结构,微孔分布均匀,微观孔隙互相连通,大小相仿,孔径2μm~8μm。该材料在负载药物微球区,即支架网格状结构的孔隙区,宏观孔隙400μm,RFP/PLGA微球和RFP/PLGA微球直径200μm~300μm,分布均匀,实心微球是RFP/PLGA微球,空心微球INH/PLGA微球。微球均匀的分布在β-TCP支架上,三维多孔β-TCP负载RFP/PLGA微球和INH/PLGA微球的总孔隙率经检测为(30.59±1.33)%。烧结后和原材料的β-TCP支架X射线衍射分析图谱显示,烧结前后无相转变。取烧结后的β-TCP支架通过抗压强度测试,孔隙400μm的β-TCP支架承受抗压能力最大,最大压缩强度为(3.31±0.64)MPa,力学性能可以达到松质骨的抗压强度2-12 MPa。二、多孔β-TCP支架负载抗结核药物缓释微球体外药物释放和降解通过该复合材料体外释放和降解实验,验证材料抗结核、成骨、降解吸收的匹配程度,为体内实验提供数据支持。结果表明,RFP/PLGA和INH/PLGA微球的载药率分别为26.0±1.2%与28.0±1.5%;每个多孔β-TCP支架的质量为401.0±13.2mg(n=10),β-TCP负载50%RFP/PLGA微球和50%INH/PLGA微球后,质量约增加79.0±7.6mg,负载药物21.33±2.34mg(RFP和INH总量)。该材料平稳释放药物约90d。在体外降解过程中,材料质量随着时间变化而逐渐降低,在15周时,材料降解质量趋于0。在降解过程中,材料的PH值逐步降低,然后在轻微升高。在降解过程中多孔β-TCP支架负载RFP/PLGA微球和INH/PLGA微球材料抗压强度逐渐降低。本实验材料在体外降解中抗压强度变化较小,开始抗压强度为3.31Mpa,第4周时为3.11 Mpa,第8周时为3.04 Mpa,第12周时为2.98 Mpa,第13周以后无法测定。三、多孔β-TCP支架负载抗结核药物缓释微球体外细胞毒性试验通过该实验旨在评价该材料的体外生物相容性和成骨性能。该复合材料和鼠骨髓间充质干细胞共同培养,发现细胞生长旺盛,在材料边界细胞生长密集,对照组24,48,72 h细胞生长通过单位面积计数,发现与实验组24,48,72 h细胞数量和阴性对照组无明显差异,两组细胞形态、细胞之间距离均无明显差异。通过金相显微镜观察多孔β-TCP支架小梁的显微结构和共同培养的细胞,观察荧光染色后的细胞,细胞在多孔β-TCP支架小梁的分布呈簇拥状,可见细胞生长于多孔材料表面和孔隙中,有些已经进入支架内部。扫描电镜观察可见在β-磷酸三钙孔隙有大鼠骨髓间充质干细胞,细胞呈梭形和不规则形,与材料表面黏附,在材料表面细胞贴壁、密集生长,长势活跃,并伸出伪足附着材料表面。四、多孔β-TCP支架负载抗结核药物缓释微球的体内实验通过对三维多孔β-TCP支架负载RFP/PLGA缓释微球和INH/PLGA缓释微球材料的特性进行了系列的体内实验研究,证实了多孔β-TCP支架负载抗结核缓释微球材料具有良好的缓释特性,三维多孔β-TCP骨组织工程支架有良好的充填骨缺损和促进成骨作用。对实验兔随机抽样进行X线摄片,四组骨缺损修复的X线表现载药组和未载药组的实验结果和体外实验结果基本一致。常规CT研究其体内降解,结果和体外实验结果基本一致。Micro-CT研究其新骨形成,结果显示载药组与未载药组在术后3周、6周、9周、12周、15周的新骨体积无明显差异(P>0.05);载药组与对照组,未载药组与对照组在术后3周、6周、9周、12周、15周的新骨体积有明显差异(P<0.05);载药组与空白组,未载药组与空白组在术后3周、6周、9周、12周、15周的新骨体积有明显差异(P<0.05);对照组与空白组在术后3周、6周、9周、12周、15周的新骨体积有明显差异(P<0.05)。以上结果说明,本实验构建的β-磷酸三钙骨组织工程支架负载复合抗结核缓释药物复合材料具有较强的抗结核和骨修复双重作用,其组织相容性良好,降解吸收、成骨、药物释放等达到了完美匹配,达到了实验设计要求。提示其在未来临床应用中会发挥它抗结核和骨修复双重作用,为结核性骨缺损修复添砖加瓦。