【摘 要】
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枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达系统相比于大肠杆菌表达系统(E.coli)而言具有明显优势,全面了解其外源蛋白过表达时胞内蛋白质组变化,掌握其应对分泌压力胁迫的机制有助于指导
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枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达系统相比于大肠杆菌表达系统(E.coli)而言具有明显优势,全面了解其外源蛋白过表达时胞内蛋白质组变化,掌握其应对分泌压力胁迫的机制有助于指导B.subtilis表达系统的改造,更好地为工业生产服务。目前对于其在外源蛋白高表达条件下分泌机制的研究主要在RNA而非蛋白质水平上进行。
本实验室构建有E.coli-B.subtilis穿梭质粒pAcc＋pUB110。此质粒上的pga基因含有淀粉酶强启动子,可使处于对数生长期的B.subtilis在淀粉诱导下大量表达积累青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase,PGA)。重组菌B.S168/pAcc＋pUB110在24 h摇瓶培养可达到1.6 g/L的表达量和10U/mL的酶活,比1999年黄艳红1.4U/mL高将近10倍[1],而比同年杨晟5.8U/ml增加近一倍[2],为研究外源蛋白高表达条件下的胞内蛋白质组学提供了很好的实验材料。
为减少胞内蛋白的损失,本文采用较简单的样品制备方法,即将收集的菌体直接重悬于裂解液中(该裂解液配方参照Aberdeen实验室并有所改进),并进行超声破碎。本实验通过测定对照重组菌B.subtilis168/pAcc＋pUB110和B.subtilis168/pUB110的生长曲线以及酶活曲线,确定以24 h为最佳取样时间点;通过蛋白浓度测定确定以在500μL裂解液中15 OD为制样菌体浓度。经双向电泳所得图谱通过软件分析显示具有较好的重复性,而且用pH3-10NL和pH4-7胶条所得电泳图谱分析得到的差异蛋白数目明显不同。利用前种胶条获得55个上调蛋白,12个下调蛋白;利用后种胶条则获得18个上调蛋白,3个下调蛋白,软件分析结果显示,两者胞内蛋白表达差异极大。经过MALDI-TOF-TOF质谱分析,通过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定出其中6个差异蛋白,其中4个与PGA高表达抑制菌体生长有关,而phoR和yxiE则与PGA高表达分泌胁迫机制有关。这些结果为了解高表达外源蛋白条件下Bacillussubtilis分泌胁迫反应机制提供了新线索。
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