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内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是可以分化为成熟内皮细胞的前体细胞,是出生后修复血管内皮的重要因子,对于维持血管内皮功能十分重要。但是在很多疾病中,EPCs功能受损,血管内皮的修复能力减弱。近年来,肥胖症已成为全球范围迅速增加的一种流行疾病。肥胖是多种因素共同作用导致的代谢障碍性疾病,环境因素是其重要的因素之一,摄入的热量超过了机体所消耗的能量,过度的热量在体内转为大量的脂肪储存。它与多种疾病密切相关,内脏脂肪组织过度堆积,尤其是过多的腹部脂肪堆积是心血管疾病的高危因素。研究报导肥胖症患者外周循环的EPCs数量下降,但是其数量减少的机制还不明确。以血清抵抗素和脂联素为代表的脂肪因子在血管性疾病中的作用已受到广泛关注。脂联素、瘦素、TNF-α均对EPCs有影响。内脏脂肪素(visfatin)作为一个新的脂肪因子,由脂肪组织产生和分泌,具有多种生物学效应,并且在血管内皮炎症中起一定作用。本课题通过观察高脂饲料喂养诱导的营养性肥胖大鼠骨髓EPCs数量及其visfatin的水平,分析EPCs数量与visfatin、糖脂代谢、高胰岛素血症及肥胖的关系,探索EPCs数量变化的机制,为及早预防及改善超重及肥胖人群的EPCs水平提供一个新的研究方向。本实验内容主要包括以下两部分:第一部分高脂饮食诱导的肥胖大鼠骨髓内皮祖细胞水平及其与visfatin关系的研究目的:建立高脂饮食诱导的营养性肥胖大鼠模型;分离培养鉴定并记数骨髓EPCs,分析骨髓EPCs的数量与血糖、胰岛素、血脂、体重及内脏脂肪的关系,探讨骨髓EPCs数量与visfatin、高胰岛素血症、糖脂代谢、肥胖等的相关性。方法:清洁级雄性Wistar大鼠(体重200-250g)22只,适应性喂养1周后随机分为正常对照组(normal control group, NC) 11只,高脂饮食组(high-fat-fed group, HF) 11只。NC组给予基础饲料(热量组成:碳水化合物占65.5%,脂肪占10.3%,蛋白质占24.2%),总热量为348 kcal/100g;HF组喂以高脂饲料(热量组成为脂肪60%,碳水化合物20%,蛋白质20%),总热量为502 kcal/100g。两组每日同时投喂饲料,每周称体重(body weight,BW) 1次。16周后测定2组大鼠的BW及Lee’s指数判断造模是否成功。造模成功后所有大鼠禁食10小时后均采用颈动脉插管抽血,分离血清,测定血清visfatin、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)、甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)等指标,其中血清visfatin、CRP采用酶联免疫(ELISA)法测定。抽血后处死大鼠,准确称量肾周和附睾脂肪重量,即为内脏脂肪(visceral adipose tissue, VAT)总重量。脂肪组织快速置于液氮中后,放在-70°C冰箱中保存。采用Western blot技术,分析VAT的visfatin表达。用磷酸盐缓冲液冲洗大鼠股骨及胫骨的骨髓腔,用大鼠淋巴细胞分离液分离出骨髓单个核细胞,用EMG-2MV培养并在倒置显微镜下观察细胞形态。9天后用激光共聚焦显微镜鉴定EPCs,10天后用免疫细胞化学鉴定EPCs,并在显微镜下记数细胞数量。结果:1.喂养16周后, HF组BW、Lee’s指数、VAT、visfatin、CRP、FBG、FINS、TG、TC、HOMA-IR显著高于NC组,差异均有统计学意义(p<0.01)。2.HF组的EPCs数量少于NC组,差异有统计学意义(P<0.01)。3.与NC组相比,HF组VAT的visfatin蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.EPCs数量与血清visfatin、CRP、VAT、FBG、HOMA-IR、TC、TG及BW呈负相关(r=-0.886、r=-0.849、r=-0.631、-0.753、r=-0.775、r=-0.744、r =- 0.821、r=-0.656)。5.多元逐步回归分析,血清visfatin、CRP进入回归方程(P<0.05)。结论:1大鼠喂养16周后,HF组BW、Lee’s指数、VAT明显高于NC组,说明营养性肥胖大鼠造模成功,并且存在腹型肥胖。2肥胖大鼠VAT的visfatin表达升高。3肥胖大鼠骨髓EPCs数量减少,且与visfatin、CRP、胰岛素抵抗、糖脂代谢、腹型肥胖、BW相关,visfatin可能参与了EPCs数量下降的发生。第二部分Visfatin对大鼠骨髓内皮祖细胞NF-κB表达影响的研究目的:研究visfatin孵育大鼠骨髓EPCs后NF-κB表达的变化。探讨visfatin在EPCs数量减少中的作用。方法:大鼠骨髓EPCs的分离及培养同第一部分。采用不同浓度visfatin孵育EPCs 24小时,采用Western blot技术,分析EPCs胞核NF-κB的表达。结果:Visfatin孵育组NF-κB的表达高于正常对照组(P<0.01)。结论:Visfatin可以诱导大鼠骨髓EPCs胞核NF-κB水平升高。