分子伴侣(molecular chaperon)是一类古老而且进化上高度保守的蛋白质。它通过参与蛋白质折叠、细胞内分布以及蛋白水解等环节对细胞生长、分化和生存起到关键的调节作用。典型的例子就是热休克蛋白家族(heat shock proteins, HSPs)。其首要的功能是作为分子伴侣促进变性的和新翻译生成的蛋白质正确折叠。其次，HSPs也参与蛋白质在细胞内的定位、抑制蛋白质的聚集和调节细胞信号传导通路以及蛋白质水解等过程。研究表明，作为一种应激反应，肿瘤细胞内 HSPs表达往往上调以恢复正常的蛋白质折叠。这种表达的上调在肿瘤发生过程中发挥着重要作用。但是，我们在既往两 cDNA微阵列分析中发现某些肺癌和神经内分泌胰腺癌中，某些编码作为抑癌基因分子伴侣HSPs的蛋白质折叠基因，在肿瘤组织中表达比相应的正常组织降低，作为抑癌基因 Rb(retinoblastoma)分子伴侣的 TNF受体相关蛋白1(TNF receptor-associated protein1, TRAP1)即为其中之一。TRAP1属于HSP90家族成员，是一种线粒体蛋白质，具有与Rb相互作用所必须的LxCxE结构。目前，对Rb作用机制的假说认为：Rb通过结合并阻止转录因子E2F的作用，从而阻止细胞从G1期进入S期。而要实现这一功能，首先需要TRAP1作为分子伴侣帮助其正确折叠。本研究分为三个部分：　　第一部分：　　目的：调查TRAP1在各种肿瘤组织内的表达情况，以证实作为抑癌基因分子伴侣的HSPs在不同肿瘤组织中的表达下调，是否是一种较普遍现象。同时也作为研究第四部分中探讨肿瘤细胞核内TRAP1蛋白水平与临床病理转归相关性分析的一部分。　　方法：首先采用Meta-analysis和real-time RT-PCR检测不同肿瘤组织中TRAP1的mRNA水平，再应用Tissue Microarrays和免疫组织化学技术(immuohistochemistry, IHC)对各种肿瘤组织中TRAP1的蛋白质水平进行大规模的调查。　　结果：正常相应对照组织细胞胞浆内TRAP1染色均为阳性；不同肿瘤组织中TRAP1在细胞内不同部位的染色结果呈异质性。相当部分肿瘤细胞中TRAP1染色为阴性，其中滤泡淋巴瘤、神经内分泌性胰腺癌、弥漫性大 B细胞淋巴瘤(DLBCL)、头颈部肿瘤和乳腺癌细胞内TRAP1染色阴性率分别为76.3％、62.2%、41.5%、27.1%和23.2%。相当部分肿瘤细胞核内TRAP1染色为阳性，其中DLBCL、滤泡淋巴瘤、神经内分泌性胰腺癌、肺腺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌头颈部肿瘤和乳腺癌细胞核内TRAP1染色阳性率分别为7.4%、2.6%、8.1%、11.5%、48.2%、60.0%、51.2%和57.6%。　　结论：结果表明TRAP1在各种肿瘤组织呈异质性表达(包括mRNA和蛋白质水平)，相当部分肿瘤会出现表达降低的情况，证明作为抑癌基因分子伴侣的TRAP1在不同肿瘤组织中的表达下调可能是一种较普遍现象。而TRAP1在部分肿瘤细胞核出现阳性染色结果提示我们作为Rb抑癌基因分子伴侣的 TRAP1可能在肿瘤发生、发展过程中发挥作用。　　第二部分：　　目的：初步探讨TRAP1细胞内定位和与Rb共定位。　　方法：首先利用Western Blot和real-time RT-PCR技术检测急性热休克和低氧应激状态下肺腺癌A549细胞株内TRAP1的变化；再应用免疫荧光(immunofluorescence, IF)和激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy, LSCM)技术，研究TRAP1在A549细胞内的定位和与Rb共定位，为进一步探讨TRAP1对Rb的构象和细胞周期调节功能的影响提供基础。　　结果：①Western Blot结果显示：急性热休克和低氧应激状态下， A549细胞全裂解液和胞浆内TRAP1水平无明显改变，但胞核内TRAP1水平有明显升高。Real-time RT-PCR结果表明不同时程的低氧处理后， mRNA水平并无明显变化，提示核内TRAP1的升高不是由mRNA合成增加引起的。②IF结果显示低氧状态下TRAP1在细胞内定位会从主要位于核周转移入核，并与Rb共存。　　结论：结果证实了低氧应激状态下，TRAP1在 A549细胞内定位会从主要位于核周转移入核并与Rb共存。这种移位提示作为Rb蛋白分子伴侣的TRAP1对Rb蛋白构象的调节可能有重要意义，进而对Rb蛋白在细胞周期中的负性调节功能有重要影响。　　第三部分：　　目的：探讨从核周转移入核的TRAP1对Rb蛋白构象和Rb在细胞周期中负性调节功能的影响。　　方法：首先采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)试验观察进入A549细胞核内的TRAP1与Rb的相互作用；再应用转染siRNA体外试验，观察RNAi沉默TRAP1对TRAP1-Rb相互作用以及Rb-E2F1相互作用的影响，最后采用FACS(fluorescence activated cell sorter)观察RNAi沉默TRAP1对Rb的细胞周期负性调节功能的影响。　　结果：①IP结果显示核内免疫复合物中的Rb明显高于胞浆部分，进一步证明低氧应激状态下TRAP1从核周转移入核，以利于发挥其分子伴侣的功能。②转染siRNA的体外试验结果表明siRNA转染后A549细胞核内TRAP1蛋白表达水平明显降低；尽管E2F1蛋白表达水平保持不变，但Rb-E2F1的相互作用减弱，在低氧应激下尤其明显。FACS结果显示，TRAP1沉默后导致Rb对E2F1的抑制作用减弱，E2F1转录作用被活化，启动DNA合成，推动细胞周期向前，更多的细胞越过G1/S期的限制点(restriction point)进入S期。　　结论：A549细胞核内TRAP1对Rb保持其正常构象和发挥其细胞周期负性调节功能具有重要意义。