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第一部分NEC患儿肠道巨噬细胞的活化、TNF-α的表达及ICCs的表型改变目的：研究NEC患儿肠道巨噬细胞的活化、TNF-a的表达及ICCs的表型改变情况,探究其在NEC发病中的作用。方法：采用HE染色、免疫荧光双染、免疫组化、Westen blot 及 RT-PCR等技术对正常小肠组织和NEC小肠组织进行对比研究。结果：HE染色—正常小肠绒毛排列整齐,肠壁无水肿及充血,而NEC患儿小肠绒毛坏死,肠壁充血,肠壁有大量炎性细胞浸润。免疫荧光双染—正常小肠有少量CD68阳性的巨噬细胞表达,未见巨噬细胞活化,而NEC肠道有大量M1型巨噬细胞浸润,未见M2型巨噬细胞表达。免疫组化和western blot-NEC组肠道TNF-a蛋白表达明显高于正常组,且TNF-a阳性表达区域主要分布于粘膜层以及环行肌和纵行肌之间。c-kit的免疫组化染色可见正常小肠ICCs主要分布于环行肌和纵行肌之间、环行肌内和纵行肌内,NEC组小肠未见c-kit阳性表达。RT-PCR结果与蛋白表达结果一致,可见NEC组小肠CD68、iNOS 及 TNF-α mRNA的表达明显高于正常组,而c-kit mRNA的表达明显低于正常组。结论：NEC肠道有大量M1型巨噬细胞浸润,TNF-α表达显著升高。在NEC发病过程中,肠道ICCs发生表型改变,这可能与肠道运动功能紊乱有关。第二部分巨噬细胞对NEC小鼠肠道ICCs表型改变的影响目的：进一步在动物模型中研究NEC肠道巨噬细胞活化、TNF-α表达及ICCs的表型改变情况,研究巨噬细胞对NEC肠道TNFF-α表达及ICCs表型改变的影响。方法：新生鼠随机分为4组：正常组,未进行缺氧、注射用药及冷刺激；NEC组,采用缺氧冷刺激的方式制作NEC动物模型：NEC+NS组,在NEC模型制作前24小时腹腔注射生理盐水60μl；NEC+CL组,在NEC模型制作前24小时腹腔注射氯膦酸二钠脂质体溶液60g1。分别于实验第2天(NEC早期)、第4天(NEC进展期)、第8天(NEC恢复期)及第15天(肠道恢复)提取小鼠小肠组织,行HE染色对肠道进行病理评分,观察各组NEC发生率,采用免疫荧光双染、免疫组化、Westen blot及RT-PCR等技术检测各组肠道巨噬细胞的活化、TNF-a的表达及ICCs的表型改变情况。结果：氯膦酸二钠脂质体在NEC早期和NEC恢复期能明显减少M1型巨噬细胞的表达,但在NEC进展期这种抑制作用减弱。在NEC早期M1型巨噬细胞低表达能明显减轻NEC肠道的损伤,降低NEC发生率和TNF-a的表达,并能减轻肠道ICCs的损伤。在NEC恢复期M1型巨噬细胞低表达能降低TNF-a的表达,促进肠道组织修复及ICCs表型的恢复。结论：M1型巨噬细胞在NEC肠道的炎性损伤中具有重要作用,抑制M1型巨噬细胞不仅能降低TNF-a的表达,减轻肠道的炎性损伤和ICCs的损伤,还能在恢复期促进肠道组织的修复及ICCs表型的恢复。第三部分TNF-α对肠道ICCs表型改变的影响及其机理研究目的：研究TNF-a抑制c-kit的表达,导致ICCs发生表型改变的机制。方法：出生24小时内将B6小鼠随机分为4组：正常对照组,对肠管进行组织培养,培养液中未加TNF-α;空白对照组,未培养的肠管；INF-α组,对肠管进行组织培养,培养液中加入不同浓度的TNF-α;miR-222拮抗组,新生小鼠腹腔注射miR-222拮抗剂24小时后对肠管进行组织培养,培养液中加入不同浓度的TNF-α。小肠组织培养48小时后采用RT-PCR及Western blot技术检测肠组织中miRNA-222、c-kit mRNA及c-kit蛋白的表达。双荧光素酶实验鉴定c-kit是否为miRNA-222的靶基因。结果：当培养液中’NF-a浓度在100-500ng/ ml时,miRNA-222的表达上调并抑制c-kitmRNA和蛋白的表达。使用miR-222拮抗剂之后,在培养液TNF-α浓度在100-200ng/ml时,可逆转这种抑制作用,但是当培养液中TNF-a浓度高于200ng/ml时,c-kit mRNA和蛋白的表达仍然被抑制。双荧光素酶实验证实c-kit是miR-222的靶基因,miR-222可通过与c-kit mRNA结合抑制c-kit的表达。结论：TNF-a可通过上调miR-222抑制c-kit的表达,miR-222拮抗剂在一定范围内可逆转这种抑制作用。