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伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)可引起多种家畜及野生动物出现以奇痒及脑脊髓炎等为特征的急性传染病。目前疫苗接种是控制PRV传播的主要方法,研究者们正着力研发保护效率更好的基因工程疫苗。本研究以实验室保存突变株rPRV-gE-/TK-和疫苗株Bartha K61(PRV-Ba)为亲本,利用Cre-loxP系统构建了无报告基因缺失株rPRV-gE-/TK-/gN-和rPRV-Ba-gN-,并对两株缺失株的生长特性及免疫效力作了初步研究,为猪伪狂犬病疫苗及病毒活载体疫苗的进一步研制提供了候选疫苗株。1伪狂犬病病毒gN基因缺失株的构建及其生长特性研究用PRV-JSZ株基因组DNA扩增出gN基因两侧的序列作为左右重组臂,以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记,构建带有两个同向loxP位点的pSKgNRL-GFP转移载体,并与双缺失株rPRV-gE-/TK的基因组DNA共转染PK15细胞。琼脂覆盖后,挑荧光斑收取病毒,并以有限稀释法纯化获得带有EGFP的重组病毒rPRV-gE-/TK-/gN-/GFP+。采用Cre重组酶敲除EGFP,有限稀释法纯化gN缺失株rPRV-gE-/TK-/gN-。用相同的方法将PRV-Ba构建成gN缺失株rPRV-Ba-gN-。对其基因组PCR产物进行序列分析,结果显示rPRV-gE-/TK-/gN或rPRV-Ba-gN在gN基因内部缺失片段大小为195bp。与亲本株rPRV-gE-/TK相比：在PK15细胞上,rPRV-gE-/TK-/gN的增殖速度前期较为缓慢,但其产生的病毒效价不受影响；在BHK21细胞上,rPRV-gE-/TK-/gN的增殖速度明显减慢,产生的病毒效价比亲本株降低了约10倍。说明进一步缺失gN基因对病毒的体外增殖有一定的影响,但在不同的细胞系上,gN的缺失对病毒生长特性所造成的影响不一致。在PK15细胞和BHK21细胞上,rPRV-Ba-gN的增殖速度明显比亲本株PRV-Ba慢,而且产生的病毒效价也显著受影响,比亲本株降低约100倍。说明gN基因的缺失在一定程度上降低了病毒的体外增殖能力。2缺失株rPRV-gE-/TK-/gN-和rPRV-Ba-gN免疫效力研究LD5o的测定结果显示,与野生株PRV-JSZ相比,gE、TK、gN基因的缺失使突变株的毒力显著降低,但rPRV-gE-/TK-/gN-和亲本株rPRV-gE-/TK-的LD50均大于1×106TCID50,所以无法比较两株病毒的毒力差别；而rPRV-Ba-gN-的毒力比亲本株PRV-Ba低。说明gN基因的缺失对病毒的毒力有一定的影响。比较采用PRV-JSZ株免疫攻毒后小鼠的存活率可知：一次免疫rPRV-gE-/TK-/gN-组的保护率高于rPRV-gE-/TK-组,两次免疫组保护率相似；rPRV-gE-/TK-/gN-组和rPRV-gE-/TK-组的保护率均高于PRV-Ba组；rPRV-Ba-gN-的保护率略高于PRV-Ba;总体上免疫保护效力与免疫剂量呈正相关；两次免疫的保护率高于一次免疫,其中106TCID50组两种免疫程序所诱导的保护率相似。由血清抗体检测结果可知,与rPRV-gE-/TK-相比rPRV-gE-/TK-/gN-可诱导小鼠产生较高的抗体水平,差异显著(P<0.05),rPRV-Ba-gN-和PRV-Ba相比,诱导产生的抗体水平稍高,差异不显著(P>0.05)；抗体水平随免疫剂量的提高而升高,两次免疫抗体水平高于一次免疫,血清抗体水平结果与疫苗的保护率一致。说明这两株gN基因缺失株均可提供给小鼠有效的免疫保护效力,rPRV-gE-/TK-/gN-株的保护率更高。