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目的:探讨Th17细胞相关因子在Graves病(Graves disease,GD)中的变化。并通过建立检测糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoidinducedtumor necrosis factor receptor,GITR)mRNA的实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,QRT-PCR)的检测方法,检测GD患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中GITR mRNA的表达水平。方法:(1)运用化学发光法检测GD未治疗组(n=22)、GD临床缓解组(n=23)患者及健康对照组(n=18)血浆中甲状腺激素(FT3、FT4和TSH)含量。(2)各组PBMC经PMA(50ng/ml)和Ionomycin(1μg/ml)刺激5h后,提取总RNA,并逆转录成cDNA。应用QRT-PCR检测RORγt、IL-17及β-actin mRNA的含量,以β-actin mRNA作为内参,以RORγt/β-actinmRNA和IL-17/β-actin mRNA的比值作为它们相对表达水平的指标,并评价GD未治疗组患者RORγt、IL-17mRNA相对表达水平与其甲状腺激素水平的相关性。同时,应用ELISA检测血浆中IL-17和IL-23的水平。(3)采用RT-PCR方法,从人PBMC获得hGITR基因片段,克降至pMD18-T载体,转化E.coli DH5α宿主菌,行蓝白斑筛选,挑取白色菌落进行酶切、PCR及测序鉴定,制备含hGITR基因的重组质粒。建立检测GITR mRNA的QRT-PCR方法,并评价该方法的线性范围、特异性及精密度水平。应用QRT-PCR检测上述PBMC中GITR和β-actin mRNA的含量,以GITR/β-actin mRNA的比值作为GITRmRNA相对表达水平的指标,并评价GD未治疗患者GITR mRNA相对表达水平与其甲状腺激素水平的相关性。同时也评价GD未治疗组患者及健康对照组PBMC中GITR mRNA相对表达水平与RORγt和IL-17 mRNA相对表达水平的相关性。结果:(1)GD未治疗组患者血浆中FT3、FF4水平均明显高于GD临床缓解组和健康对照组(P<0.05),TSH水平明显低于GD临床缓解组和健康对照组(P<0.05)。而GD临床缓解组血浆中甲状腺激素水平与健康对照组相比均无统计学意义(P>0.05)。(2)GD未治疗组患者PBMC中RORγt mRNA相对表达水平明显高于GD临床缓解组(χ~2=11.76,P<0.01)和健康对照组(χ~2=6.62,P<0.05),而在GD临床缓解组和健康对照组之间其表达水平无明显差异(χ~2=0.42,P>0.05)。同样,GD未治疗组患者PBMC中IL-17 mRNA相对表达水平明显高于GD临床缓解组(χ~2=20.91,P<0.01)和健康对照组(χ~2=26.92,P<0.01),而在GD临床缓解组和健康对照组之间无明显差异(χ~2=0.84,P>0.05)。GD未治疗组患者血浆中IL-17水平明显高于GD临床缓解组(χ~2=26.67,P<0.01)和健康对照组(χ~2=32.08,P<0.01),而在GD临床缓解组和健康对照组之间无明显差异(χ~2=0.68,P>0.05)。GD未治疗组患者RORγt、IL-17mRNA相对表达水平与其FT3、FT4均呈正相关(P<0.05),而与TSH均呈负相关(P<0.05)。同样,GD未治疗组患者血浆中IL-23水平明显高于GD临床缓解组(χ~2=23.91,P<0.01)和健康对照组(χ~2=35.88,P<0.01),而在GD临床缓解组和健康对照组之间无明显差异(χ~2=2.01,P>0.05)。(3) pMD18T-hGITR重组质粒,经PCR鉴定可见103bp的目的条带,测序结果显示与GenBank中GITR mRNA序列完全一致。通过优化反应体系和反应条件,成功建立检测GITR mRNA的QRT-PCR方法,该方法标准曲线的相关系数r~2为0.999,线性范围为(10~1～10~6)copies/μl,最低检出限达10~1copies/μl,批内CV为6.4%,批间CV为13.7%和10.2%。检测结果表明GD未治疗组患者PBMC中GITR mRNA相对表达水平显著低于GD临床缓解组(χ~2=18.48,P<0.01)和健康对照组(χ~2=18.26,P<0.01),而在GD临床缓解组和健康对照组之间无明显差异(χ~2=0.12,P>0.05)。GD未治疗患者GITRmRNA相对表达水平与其FT3(r=-0.509,p=0.015)、FT4(r=-0.483,p=0.023)均呈负相关,而与TSH呈正相关(r=0.458,p=0.032)。GITR与RORγt mRNA相对表达水平在GD未治疗组(r=-0.475,p=0.009)和健康对照组(r=-0.436,p=0.011)均呈负相关。同样,GITR与IL-17mRNA相对表达水平在GD未治疗组(r=-0.536,p=0.002)和健康对照组(r=-0.492,p=0.008)也均呈负相关。结论:(1)本研究结果提示GD患者体内Th17细胞相关的RORγt、IL-17和IL-23表达水平明显增高。(2)本研究建立的检测GITR mRNA的QRT-PCR方法灵敏、特异且重复性好。检测结果表明GD患者体内的GITR mRNA相对表达水平明显偏低。