天然产物是药物、食品添加剂的主要来源之一,作为高附加值原材料被广泛应用于食品、医药、化妆品行业。目前,植物提取法和化学合成法是在天然产物工业生产中常用的方法。传统的植物提取法效率低、分离工艺复杂,而且,植物的生长受土壤质量、气候以及其他外部因素限制。化学合成法难以实现从头合成、所需的反应条件苛刻、容易造成环境污染。不同于以上两种天然产物获得方法,通过生物合成法可利用微生物细胞工厂以廉价的碳源作为原料生物合成高附加值目标化合物,该法具有低成本、高效、环保及可持续等优势。近年来,生物合成法受到研究者们的广泛关注。在合成生物学理论的指导下,采用分子生物学技术,对微生物细胞进行系统的代谢工程改造,实现微生物细胞工厂高效生产天然产物是满足日益增长的天然产物市场需求的可行策略。迄今为止,实现以微生物作为细胞工厂生物合成芳香类化合物的生产方式在工业化生产中的应用依然面临挑战。酪醇是一种来源于橄榄的芳香类化合物,具有抗氧化、消炎等功效,同时,也是重要心血管药物红景天苷的直接前体。红景天苷被广泛应用于医药、食品、化妆品行业。但是,目前通过代谢工程改造酿酒酵母用于酪醇及红景天苷的生物合成,所获得的总产量小于2 g/L。为了实现酿酒酵母高效生物合成酪醇及红景天苷,在本研究中,我们开发了一系列理性的代谢工程改造策略,并且通过对酿酒酵母工业菌株进行系统的代谢工程改造,显著地提高了酪醇及红景天苷的产量。本论文的主要研究内容及结果如下:(1)代谢工程改造酿酒酵母高效生物合成酪醇比较分析了两条外源的可将酪氨酸转化为酪醇的生物合成途径TDC-TYO途径和PcAAS途径对酿酒酵母生物合成酪醇的影响。研究结果表明,PcAAS途径比TDC-TYO途径更有助于酿酒酵母中酪醇的生物合成,导入PcAAS途径的酿酒酵母菌株的酪醇产量相对于对照菌株提高约1 17倍。由于酿酒酵母存在Crabtree效应,以葡萄糖为碳源培养时会产生大量的副产物乙醇。因此,为了降低乙醇分支途径的碳流量以提高目标化合物酪醇的产量。我们通过敲除酿酒酵母乙醇分支途径的主要丙酮酸脱羧酶基因PDC1,使酪醇产量提高了 18.53%。此外,为了增强莽草酸途径的终产物——分支酸向酪醇生物合成方向的碳流量,我们在pdc1位点分别异源表达了大肠杆菌来源的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的双功酶基因EctyrA及其酪氨酸反馈抑制不敏感突变体EctyrAM53I/A354V,酪醇产量分别提高了 33.59%和35.18%。为了促进酪醇生物合成的工业化应用进程,实现以酿酒酵母工业菌株作为出发菌株构建高效生物合成酪醇及其衍生物的微生物细胞工厂。首先,为了方便代谢工程改造,我们对多株二倍体酿酒酵母工业菌株进行了单倍体分离实验,获得了 4株来源于不同菌株具有不同配型的单倍体工业菌株。基于菌株的酪醇生产水平,通过筛选获得了酪醇产量较高的单倍体酿酒酵母工业菌株HLF-Dα。与前期实验中使用的酿酒酵母实验菌株相比,酿酒酵母工业菌株的鲁棒性更好,其发酵性能更加稳定。通过将前期构建的代谢工程改造策略应用到了 HLF-Dα中,获得了高产酪醇酿酒酵母工业菌株DA-1,该菌株在72 h摇瓶培养后,酪醇产量达到742.02±22.45mg/L,与出发菌株HLF-Dα相比,提高约11倍。该菌株被作为进一步代谢工程改造酿酒酵母高效生产酪醇的平台菌株。随后,我们对酿酒酵母中酪醇生物合成的前体之一——赤藓糖-4-磷酸(Erythrose-4-phosphate,E4P)的生物合成途径进行了优化。首先,我们尝试通过过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因ZWF1以增强酿酒酵母内源的E4P生物合成途径-磷酸戊糖途径(Pentosephosphatepathway,PP途径)。研究结果显示,过表达ZWF1后,酪醇产量和生物量均没有显著变化。我们推测,由于磷酸戊糖途径较为复杂,并且存在许多已知和未知的限速反应步骤,通过改造内源的E4P生物合成途径很难实现酪醇产量的提高。随后,我们寻找到一条外源的基于磷酸酮醇酶(Phosphoketolase,Xfpk)的E4P生物合成途径——Xfpk途径,通过对两条途径的热动力学参数进行比较分析,我们发现与PP途径相比,以葡萄糖作为碳源生物合成E4P时,通过Xfpk途径仅需4步,其最大反应驱动力约为PP途径的2倍,且不需要耗能及辅因子的参与,并且,其理论转化效率为PP途径的2倍。以上动力学分析结果表明,Xfpk途径是一条潜在的高效的E4P生物合成途径,可被应用于提高酿酒酵母酪醇及其他芳香类化合物的生物合成。通过将来源于青春双歧杆菌的磷酸酮醇酶基因Baxfpk在酿酒酵母的不同位点(PHA2、XKS1、GRE3)进行表达,我们发现,在PHA2位点表达Baxfpk优于XKS1和GRE3位点,更有助于酪醇产率的提高。此外,我们对不同来源的Xfpk酶进行了筛选,分别将来源于短双歧杆菌和牙齿双歧杆菌的磷酸酮醇酶基因Bbxfpk和Bdxfpk在PHA2位点进行了表达,发现Bbxfpk表达菌株的酪醇产率最高。该研究结果表明,Xfpk途径的导入是提高酿酒酵母酪醇的产量的有效策略,与BaXfpk和BdXfpk相比,BbXfpk的导入更有助于提高酿酒酵母酪醇生物合成。由于在Xfpk催化底物果糖-6-磷酸(Fructose 6-phosphate,F6P)生成E4P时,会生成1分子乙酰磷酸(Acetyl-phosphate,AcP),AcP可被酿酒酵母内源的甘油磷酸酶GPP1p和GPP2p催化生成乙酸,从而造成发酵过程中乙酸的积累。过量的乙酸积累会对酿酒酵母的发酵产生抑制作用。磷酸转乙酰酶Pta可催化AcP可逆地转化为乙酰辅酶A,缓解乙酸积累对菌株发酵产生的抑制作用。因此,我们敲除了酿酒酵母中主要的甘油磷酸酶基因GPP1,并异源表达了来源于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的磷酸转乙酰酶基因Ckpta。但是,研究结果表明,导入Ckpta后不仅无法缓解乙酸积累,而且不利于酪醇的生物合成。由于莽草酸途径的关键酶基因受到产物芳香类化合物的反馈抑制,限制了芳香类化合物产量的进一步提高。因此,我们构建了解除芳香类氨基酸反馈抑制的突变体AR04K229L和AR07G141S,并将其插入在酿酒酵母中ARO3位点进行表达。研究结果表明,通过突变解除芳香类氨基酸对莽草酸途径的反馈抑制后,酪醇产量提高了 27.54%。最终,我们通过葡萄糖分批补料发酵实验,获得了 8.37g/L的酪醇产量,该产量是目前已报道的酿酒酵母生物合成酪醇的最高产量。(2)代谢工程改造酿酒酵母高效生物合成红景天苷酪醇是红景天苷,羟基酪醇等心血管药物合成的直接前体。目前,红景天苷已被广泛应用于医药,食品及化妆品等行业。基于酪醇高产工程菌株DA-9,我们拟通过进一步代谢工程改造,构建高效生产红景天苷的酿酒酵母工程菌株。通过在酪醇高产菌株DA-9的TRP3位点表达来源于拟南芥的葡萄糖苷转移酶基因ugt85a1,构建了酪醇向红景天苷的转化途径,获得了产红景天苷菌株DA-91 菌株。经葡萄糖分批补料发酵实验,该菌株在发酵 216 小时后,其酪醇和红景天苷产量分别达到8.47 g/L和1.82 g/L,这是目前为止,以酿酒酵母为底盘细胞获得的最高产量。