论文部分内容阅读
卵母细胞胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)作为治疗严重少弱精子症病人的有效方法,现在已经被广泛应用于临床,并出生了大量ICSI受精试管婴儿。在临床上,仍有部分非梗阻性无精子症病人无法产生正常的成熟精子,但可以从其精液或睾丸活检标本中回收到圆形精子细胞(round spermatid,ROS)。已经证明,ROS作为最早的单倍体雄性生殖细胞将其显微注射到卵母细胞后可以形成雄原核并参与配子配合。因此,圆形精子细胞注射(Round Spermatid Injection,ROSI)在临床上作为治疗男性不育的一种新手段,为那些因为不能产生成熟精子而不育的男性提供了生育自己遗传学子女的机会。目前,虽然已经出生了ROSI试管婴儿,但是ROSI仍然存在受精率低,后代出生率低等问题。主要原因可能在于ROSI后卵母细胞不能激活;ROS携带的中心体功能不完善或异常,不能在卵母细胞内充当微管组织中心;ROSI后圆形精子细胞核在卵母细胞内重塑异常等。因此,需要深入研究这些问题,以期望改善ROSI受精效果,更好地为人类辅助生殖临床服务。另外,分析ROS不能激活卵母细胞的原因,研究ROS携带的中心体在卵母细胞内组织微管的能力以及圆形精子细胞核在卵母细胞内的重塑情况,对丰富受精时卵母细胞激活机制的内容,阐明中心体在受精中的作用,以及精子形成时精核致密化的作用都具有重要意义。本研究利用ROSI技术,免疫荧光技术,激光扫描共聚焦显微术,蛋白激酶活性分析等技术,以山羊ROS和体外成熟的山羊卵母细胞为实验材料,主要研究了山羊圆形精子细胞卵胞质内注射后支持胚胎发育的能力,并从以下几个方面详细分析了圆形精子细胞不能支持胚胎发育的原因:(1)圆形精子细胞卵胞质内注射后卵母细胞激活情况,(2)圆形精子细胞卵胞质内注射后MPF和MAPK活性变化情况,(3)圆形精子细胞卵胞质内注射后钙振荡情况,(4)山羊圆形精子细胞对小鼠卵母细胞的激活能力和引发钙振荡情况,(5)多个山羊圆形精子细胞对山羊卵母细胞的激活能力和引发钙振荡情况。另外,本文还比较了成熟精子和圆形精子细胞核在卵母细胞内的重塑情况,观察了圆形精子细胞中心体在卵母细胞内组织微管的情况,并优化了山羊ROSI卵母细胞激活方案。主要试验结果如下:1.山羊圆形精子细胞卵胞质内注射后仅有9.9%的卵母细胞卵裂,并且不能发育到囊胚,ICSI后卵母细胞的卵裂率和囊胚率分别为66.1%和28.6%,说明山羊圆形精子细胞不能支持胚胎发育。2.ICSI后70.6%的卵母细胞被激活,而ROSI后仅有14.8%的卵母细胞被激活,这一激活率显著低于ICSI组的激活率,说明山羊圆形精子细胞卵胞质内注射后胚胎不能发育的原因是由于山羊ROS不能激活卵母细胞。3.山羊圆形精子细胞卵胞质内注射后用Ionomycin处理能显著改善卵母细胞激活;山羊ROS能在激活的ROSI卵母细胞内形成雄原核(MPN)。4.ICSI后山羊卵母细胞的第二次减数分裂核进程为:0-0.47h为M II期,0.47-2.0h为Ana II,2.0-2.9h为Tel II,2.9h以后为PN期。5.ICSI后和ROSI后用Ionomycin激活处理,卵母细胞内MPF和MAPK活性显著下降,而ROSI后卵母细胞内MPF和MAPK活性几乎不发生变化,说明山羊圆形精子细胞卵胞质内注射后卵母细胞不能激活的原因是MPF和MAPK活性不下降。6.山羊精子可引起卵母细胞内钙振荡,ROS不能引起卵母细胞内[Ca2+]i升高,ROSI后Ionomycin激活仅在激活处理时出现[Ca2+]i升高。说明山羊ROS卵胞质内注射后不能引起卵母细胞内钙振荡是MPF和MAPK不能灭活的原因,并由于这一原因最终导致卵母细胞不能激活。7.山羊ROS能够激活小鼠卵母细胞并能引发小鼠卵母细胞内钙振荡,说明山羊ROS内已经产生了卵母细胞激活因子。8.随着注射的山羊ROS个数的增加,山羊卵母细胞的激活率显著增加,并且注射4个山羊ROS可引起山羊卵母细胞内钙振荡,说明山羊ROS产生的卵母细胞激活因子较少,没有达到激活卵母细胞的阈值。9.ICSI后精子在卵母细胞先解凝,然后形成雄原核;ROSI后圆形精子细胞核在卵母细胞内先发生核膜破裂(nuclear envelop breakdown,NEBD),然后发生染色体提前凝集(premature chromosome condensation,PCC);ROSI后用Ionomycin激活处理,圆形精子细胞核在卵母细胞内不发生核膜破裂,一直到形成雄原核。10.精子中心体可以在卵母细胞内组织精子星体,发挥微管组织中心的功能;在ROSI后激活的卵母细胞内,ROS中心体不能组织精子星体;在ROSI后未激活的卵母细胞内,组织微管模式与前两者不同,不是通过中心体组织微管,而是在染色质介导下的微管的自组织。11.在优化ROSI卵母细胞激活方案时,ROSI前后对卵母细胞进行一次激活和两次激活在激活率和卵裂率上没有差异,但在2PN的比例和囊胚率上,前激活显著高于后激活,前后两次激活效果最好。12.山羊卵母细胞和ROSI卵母细胞在Ionomycin激活后1.5h加入6-DMAP既不影响第二极体排出,也不影响原核形成。13.6-DMAP处理虽然不影响前后两次激活处理的ROSI卵母细胞的卵裂率,但能显著提高囊胚率。总之,本研究的试验结果可以得出以下四条重要结论:(1)山羊ROS虽然已经产生了卵母细胞激活因子,但一个ROS内的含量较少,没有达到引起卵母细胞内[Ca2+]i升高的阈值,不能引起卵母细胞内[Ca2+]i升高,继而不能灭活MPF和MAPK,导致卵母细胞不能激活,因此,山羊圆形精子细胞卵胞质内注射后胚胎不能发育;(2)精子和精子细胞核在卵母细胞内重塑的模式不同。(3)精子和精子细胞在卵母细胞内组织微管的模式不同。(4)山羊ROSI卵母细胞最佳激活方案是:卵母细胞用10μM Ionomycin处理2min,1h后进行ROSI,ROSI后再用5μM Ionomycin处理2min,从第一次Ionomycin处理后1.5h开始用2mM 6-DMAP处理2h。