目的:肌萎缩侧索硬化（AmyotrophicLateralSclerosis，ALS）是最常见的运动神经元病，它以皮层、脑干以及脊髓的运动神经元的进展性变性为特征，导致肌萎缩、瘫痪，最终因呼吸肌功能障碍而死亡。大约5％-10％的ALS是遗传性的（家族性），大多数是散发的ALS。研究证实基因突变与ALS的发病相关，SOD1是第一个被认知的突变基因，在家族性的ALS中，大约10％-20％与SOD1的突变有关。表达人突变SOD1基因的转基因小鼠的临床以及病理表现与人ALS极为相似，因此建立了许多表达人突变SOD1的转基因小鼠模型，其中hSOD1G93A转基因小鼠应用最广泛，是国际上公认的ALS的动物模型，用来阐述ALS的发病机制以及作为临床药物研究的动物模型。作为一个多因素作用的疾病，除了基因突变外，蛋白的错误折叠以及聚集、谷氨酸兴奋毒性、神经炎性、氧化应激和线粒体的功能障碍、细胞骨架异常以及轴浆运输缺陷等也参与ALS的发病。近年来，内质网应激作为ALS一个新的发病机制，被深入研究。　　 内质网作为分泌路径中一个重要的细胞器，参与了蛋白质的合成、折叠和翻译后修饰，还参与脂类代谢、钙的存储，同时将这些合成与修饰后的蛋白质运输到其他细胞器。内质网内蛋白折叠能力下降、钙平衡紊乱都会引起内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。在hSOD1G93A转基因小鼠中，突变SOD1基因表达突变的SOD1蛋白，突变的SOD1蛋白易于在内质网腔内聚集以及形成包涵体，引起内质网应激。其主要通过未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）和内质网相关降解（endoplasmicreticulumassociateddegradation，ERAD）途径清除突变的SOD1，减轻内质网负荷，恢复内质网稳态。若不能及时清除突变SOD1，SOD1突变蛋白大量聚集，则会引起细胞凋亡。UPR表现为PEKR通路、IRE1通路、ATF6通路的激活。其中PERK作为第一个被激活的信号通路，在ALS的发病机制中具有重要作用。　　 本实验以hSOD1G93A转基因小鼠为研究对象，以p-eif2α作为PERK通路激活的靶点，通过观察其在hSOD1G93A转基因小鼠腰髓中的变化，来研究在hSOD1G93A转基因小鼠腰髓中是否存在PERK通路的激活，进而探究内质网应激在ALS发病机制中的作用。　　 方法:　　 1.动物模型的获得与分组　　 以B6SJL-TG(SOD1-G93A)1Gur/半合子雄鼠与B6SJLF/F1/J+/+雌鼠交配，获取其子代小鼠，剪尾提取DNA，进行hSOD1G93A基因的PCR反应，鉴定出含hSOD1G93A基因的阳性小鼠和不含该基因的阴性小鼠。　　 将hSOD1G93A转基因小鼠分为:28天组（出生后28天）、35天组（出生后35天）、49天组（出生后49天）、63天组（出生后63天）、症状早期组（出生后约90天，2分）、终末期组（出生后约120天，5分）。症状早期组和终末期组均按照SnowRJ评分标准来评估。每组各3只，均设立同窝同年龄对照。　　 2.观察hSOD1G93A转基因小鼠脊髓中p-eif2α的变化　　 2.1.蛋白免疫印迹法(Westernblot)　　 将各组hSOD1G93A转基因小鼠(Tg)和对照小鼠(control)用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉后，新鲜取出小鼠腰段脊髓，-80℃保存备用。提取腰段脊髓总蛋白，通过Westernblot方法测定p-eif2α在hSOD1G93A转基因小鼠不同时期的表达。　　 2.2.免疫荧光化学染色　　 将各组hSOD1G93A转基因小鼠(Tg)和对照小鼠(control)用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉后，用4％的多聚甲醛固定，取出腰段脊髓，浸泡于4％多聚甲醛中备用。冰冻切片，每片厚20μm。通过免疫荧光化学染色观察p-eif2α的表达。　　 2.3.免疫组织化学染色　　 将各组hSOD1G93A转基因小鼠(Tg)和对照小鼠(control)用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉后，用4％多聚甲醛固定，取出腰段脊髓，浸泡于4％多聚甲醛中备用。震动切片，每片厚25μm。用免疫组织化学染色方法观察p-eif2α在不同时期的表达变化。　　 结果:p-eif2α的Westernblot、免疫荧光化学染色和免疫组织化学染色结果显示:在hSOD1G93A转基因小鼠不同时期腰髓中均有内质网应激的发生，主要表达于前角运动神经元，但程度不同。1.p-eif2α在Tg组症状早期表达增多，且最为显著，终末期次之，但均较其他各组以及control组增多;2.p-eif2α在Tg组以及control组表达均位于脊髓前角运动神经元的胞浆中，不同时期表达不同，以症状早期Tg组胞浆中的表达最多;3.在Tg组随着疾病的进展脊髓运动神经元胞浆着色变深，胞核无着色，以症状早期组最为显著，在症状早期后组织出现空泡化，运动神经元皱缩，数目减少，control组运动神经元p-eif2α表达也位于胞浆，不同时期着色没有明显差异，且在症状早期以及终末期control组中未见到运动神经元的皱缩以及数目的明显减少。　　 结论:内质网应激在hSOD1G93A转基因小鼠不同时期腰髓中均有发生，但以症状早期以及终末期最为明显，且主要发生在腰髓的前角运动神经元中，从而证实PERK通路的激活，揭示了内质网应激参与了ALS的发病。